Лада 2019 года: купить, продать и обменять машину

alexxlab
Ноя 05 1972
Разное

Содержание

Lada Vesta Sport 2019 обзор, комплектации и цены, характеристики

Обзор Vesta Sport

LADA Vesta Sport.


Твой драйв. Твои правила

LADA Vesta Sport – автомобиль, построенный с применением гоночных технологий и адаптированный к ежедневным поездкам по городу и шоссе. LADA Vesta Sport – это особый яркий стиль, полностью перенастроенное шасси и мотор, форсированный до 145 л.с.

Удовольствие энергичного вождения

LADA Vesta


Совершенство – в графике и характере

LADA Vesta Sport заряжена не только конструктивно, но и визуально – благодаря специальному аэродинамическому обвесу, который формирует эксклюзивный стиль автомобиля. Спойлер на багажнике снижает подъемную силу и подчеркивает стремительный силуэт. Традиционный для гонок красный цвет применен и в деталях кузова, и в отделке салона: яркой нитью прострочена кожаная обшивка рулевого колеса, в красный цвет окрашены шкалы комбинации приборов.

Мультимедийная система

Мультимедийная система с 7-дюймовым экраном – это любимая музыка, новости по радио, телефонная связь hands free. Все, что нужно, чтобы поездка проходила быстрей и приятней! А навигатор сделает путешествие не только быстрее, но и проще, эффективней. На экран мультимедиа выводится изображение с камеры заднего вида – вместе с парктроником это обеспечивает уверенное маневрирование в тесноте городов.

Высокий уровень защиты

У LADA Vesta Sport — специальная тормозная система, разработанная, чтобы автомобиль со спортивным характером мог уверенно замедляться с высоких скоростей. Увеличен диаметр переднего тормозного диска, снижена температурная нагрузка на диск, увеличены передние тормозные колодки и передние тормозные поршни. Система контроля устойчивости ESC обладает особыми настройками, сочетающими азарт и безопасность вождения..

Двигатель

Форсированный мотор LADA Vesta Sport объемом 1,8 л. получил перенастроенную систему регулировки фаз газораспределения, оригинальные распредвалы, спортивные калибровки контроллера и модернизированную систему впуска и выпуска. А специальные настройки шасси обеспечивают максимальное пятно контакта с дорогой, снижают крены кузова, обеспечивают четкую реакцию на поворот рулевого колеса.

Рабочий объем 1774 см
Мощность 145 л.с. (106,6 кВт) при 6000 об/мин
Момент крутящий 184 Нм при 3600 об/мин
Нормы токсичности ЕВРО-5

Любая модель LADA Vesta теперь может стать еще более яркой, контрастной и стильной. Достаточно заказать опционное покрытие крыши и наружных зеркал в черном глянцевом цвете. Какое сочетание смотрится лучше? Черный и красный? Черный и синий? А может, черный и оранжевый? Выбирать вам! Черная крыша применяется совместно со всей палитрой эмалей LADA Vesta, исключая «Маэстро» и «Фантом».

LADA Vesta Sport в наличии

Комплектации и цены LADA Vesta Sport

Технические характеристики Лада Веста Спорт

Количество мест для сидения
Дорожный просвет при снаряженной массе, мм
Длина / ширина / высота по антенне, мм
Длина / ширина (по зеркалам) / высота по антенне, мм
Длина / ширина / высота (по рейлингам), мм
Дорожный просвет при порожней нагрузке, мм
Схема компоновки
Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах, л
Длина / ширина (по зеркалам) / высота, мм
Колесная формула / ведущие колеса
Расположение двигателя
Тип кузова / количество дверей
Длина / ширина / высота, мм
База, мм
Колея передних / задних колес, мм
Дорожный просвет, мм
Объем багажного отделения, л
Длина / ширина / высота по рейлингам, мм

Количество и расположение цилиндров
Объем топливного бака, л
Степень сжатия
Объем газового баллона, л
Тип двигателя
Система питания
Рабочий объем, куб. см
Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.
Топливо
Код двигателя
Рекомендуемое топливо
Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин.

Максимальная скорость, км/ч
Время разгона 0-100 км/ч, с

Городской цикл, л/100 км / куб. м/100 км
Загородный цикл, л/100 км / куб. м/100 км
Смешанный цикл, л/100 км / куб. м/100 км
Городской цикл, л/100 км
Загородный цикл, л/100 км
Смешанный цикл, л/100 км

Масса в снаряженном состоянии, кг
Максимальная масса прицепа без тормозной системы / с тормозной системой, кг
Технически допустимая максимальная масса автопоезда, кг
Максимальная масса прицепа, кг
Технически допустимая максимальная масса, кг

Тип трансмиссии
Передаточное число главной передачи

Передняя
Задняя

Рулевой механизм

Размерность

Фотографии

Фотогалерея Vesta Sport

Компактный седан Vesta приобрел новый смысл в серии LADA Vesta Sport, вышедшей в конце 2018 года. Кузов стал более заниженным, обретя клиренс 145 мм. Концепции и линии сохранились, но приобрели более плавные очертания. В частности, изменилось строение колесных арок и переднего бампера. Шасси от Веста сохранило конструкцию, но получило новые настройки. К началу продаж этот седан обещает стать самым популярным аналогом бюджетных автомобилей со спортивными амбициями.

Экстерьер нового Лада Веста Спорт объединяет аэродинамические черты с удобными для городского передвижения. Впервые производитель применяет в оптике функцию дублирования поворотов, задействовав противотуманные фары. Колеса имеют надежное крепление с помощью пяти шпилек, что упрощает замену резины или смену колеса при аварии.

Салон Vesta Sport будет иметь отличия, в зависимости от цены комплектации, но общие черты известны уже сейчас. Например, отчетливо выделяющаяся боковая поддержка сидений впереди. А также функциональное рулевое колесо и удобно скомпонованная панель элементов для быстрого переключения. В базовый пакет войдут основные системы поддержки и стабилизации, фронтальные подушки безопасности, комплекс поддержки и навигации с сенсорным экраном. Опционально будут предложены климат-контроль, датчики дождя и света, камера-парктроник и подогрев сидений.

Тормозная система нового Веста Спорт получила новые дисковые тормоза передних колес. Рев 145-сильного мотора согревает сердце на высоких оборотах, а на низких автоматически стихает. За это отвечает новая выхлопная система с функцией шумоподавления. В целом, купить этот автомобиль стоит свеч, ведь производитель создает его почти с нуля, из 205 сертифицированных и проверенных деталей.

Руководства по эксплуатации

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 29.10.20

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 27.08.20

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 07.07.20

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 25.03.20

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 26.02.20

 Дополнение к руководству по эксплуатации LADA Vesta CNG от 26.02.20

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 31. 01.20

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 15.11.19

 Дополнение к руководству по эксплуатации LADA Vesta CNG от 04.06.19

 Мультимедийная система LADA Vesta от 04.06.19

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 04.06.19

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 28.02.19

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 11.01.19

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 21.11.18

 Дополнение к руководству по эксплуатации LADA Vesta Sport от 01.10.18

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 31.08.18

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 20.06.18

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 06.02.18

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 21.12.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 04.10.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 21.08.17

 Дополнение к руководству по эксплуатации LADA Vesta CNG от 23. 06.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 05.06.17

 Мультимедийная система LADA Vesta от 31.05.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 28.04.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 17.03.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 01.03.17

 Мультимедийная система LADA Vesta от 13.01.17

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 23.12.16

 Мультимедийная система LADA Vesta от 20.10.16

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 09.09.16

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 14.07.16

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 21.06.16

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 20.04.16

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 25.02.16

 Мультимедийная система LADA Vesta от 01.02.16

 Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 29.01.16

  Руководство по эксплуатации LADA Vesta от 24. 11.15

  Мультимедийная система LADA Vesta от 04.11.15

Купить Лада Веста Спорт в Москве

На сайте официального дилера Major Lada вы можете купить Лада Веста Спорт в Москве по выгодной цене. Для уточнения комплектаций Lada Vesta Sport и технических характеристик, закажите обратный звонок.

Гандбольная «Лада» проиграла «Астраханочке» — Волга Ньюс

ТОЛЬЯТТИ. 24 СЕНТЯБРЯ. ВОЛГА НЬЮС.

Читали: 164

Версия для печати

Если вы нашли ошибку в тексте — выделите ее и нажмите CTR+Enter

В своем третьем матче предварительного этапа «OLIMPBET Суперлиги — чемпионата России» в Тольятти «Лада» уступила «Астраханочке» из Астрахани — 21:23 (12:9).

Фото: пресс-служба ГК «Лада»

Проблемный характер этого принципиального противостояния для хозяек поля проявился сразу. Почин создала наша воспитанница Дарья Васильева (экс-Самохина) двумя подряд дебютными голами. Третий команда в красной форме загрузила в ворота Дарьи Деревень на исходе стартовой пятиминутки, и хмурые перспективы встали перед «Ладой» в полный рост (0:3). Смутные сомнения ей посчастливилось развеять не без помощи численного большинства, буквально выстраданного Вероникой Никитиной в единоборстве с Марией Дудиной. Валентина Рахмаева с Ольгой Фоминой два мяча отыграли, а следом та же Фомина как по инерции уже в уравненных составах восстановила паритет (4:4).

На 13-й минуте в первый раз с начала матча захватили лидерство, еще больше надавили на защиту астраханок… Но другая бывшая тольяттинка (только с волгоградскими корнями) Полина Шаркова-Ведехина своими «ответками» никак не давала подопечным Екатерины Маренниковой развить свой успех.

Тем не менее, за двенадцать минут до перерыва, после очередного гола Вероники Никитиной, тольяттинки все еще оставались на один мяч впереди. Но после счета 8:7 «Ладу» напрочь заклинило в плане поиска ключей к воротам красно-белых. И длилась эта неприятность почти шесть с половиной минут.

На данном интервале нам удался всего один запоминающийся эпизод, который, впрочем, взятием ворот не увенчался. Ирина Никитина с помощью изящной нестандартной передачи оставила Алену Амельченко тет-а-тет с голкипером. Но шедевр был недоработан. Эвелина Аношкина не дала линейному тольяттинок перебросить мяч через себя. Не беда. Концовку тайма та же Никитина под номером 77 все же превратила в свой бенефис. Перед антрактом «Лада» разразилась четырьмя подряд безответными «выстрелами», и ко всем оказалась причастна Ирина. Один гол она техничным броском забила сама и еще трижды поднесла «снаряды» одноклубницам.

Амельченко, словно извиняясь за предыдущий досаднейший промах, отличилась после ее «ассистов» дважды, и перерыв визави встретили с обнадеживающей для нас разницей «плюс 3». Однако после отдыха все для команды, вышедшей на матч в праздничной (в честь юбилея клуба) голубенькой форме, пошло наперекосяк. Освежив состав, «Лада» вдруг опять забуксовала. Только Юлия Кунцевич вошла в игру со знаком качества, то и дело срывая за свои «спасения» в «рамке» овации трибун. У других «нововведенцев» получалось, мягко говоря, не очень. Да и прежние «моторы» автозаводчанок начали сбоить.

Ирина Никитина неоднократно выстрелила по «воробьям», и не она одна… После первой трети тайма счет сравнялся (14:14). А на исходе 44-й минуты гости снова оказались впереди. У Маренниковой вскоре лопнуло терпение, и она запросила тайм-аут. Да и как иначе, если за полтайма с лишним «Лада» отгрузила астраханкам только жалких три мяча. Но и дальше капризный «снаряд» в сетку подопечных Алексея Алексеева толком не шел. Аношкина (тоже, к слову, тольяттинская воспитанница) была в воротах как кремень. Два подряд пенальти «съела» и ее молодая сменщица Анастасия Рябцева.

Все это привело к тому, что за семь с половиной минут до финальной сирены Шаркова, мастерски реализовав задумку гостевого тренерского штаба после тайм-аута, довела отрыв до трех мячей. А спустя еще минуту с небольшим дошло до «минус четырех». У блиставшей доселе Кунцевич запас то ли энергии, то ли куража иссяк. Удалось своим молодецким напором оживить тольяттинок 18-летней Екатерине Терлецкой. Старшие ее примером заразились и даже вдвое сократили отставание. Но…

Подбодрили огорченную своей уже второй осечкой в нынешнем сезоне «Ладу» разве что послематчевые оптимистичные слова президента АвтоВАЗа Максима Соколова, который впервые побывал на гандболе в Тольятти, и мэра города Николая Ренца, вышедших на награждение лучших по итогам матча (Кунцевич и Аношкиной). Смысл их обращенных к публике и участницам встречи речей свелся, по большому счету, к одной истине, причем абсолютно бесспорной: «Борьба получилась красивой, зажигательной, корректной и бескомпромиссной, сезон только начался, и все еще впереди!», — сообщает пресс-служба тольяттинского клуба. 

Вход / Регистрация

Популярные материалы

Читаемое Комментируемое

сегодня неделя месяц

Топ 100

Гид потребителя

«Ох уж эти сказочки»: можно ли заработать на новогодних акциях от банков

Стало известно, где и когда пройдут зимние соревнования по рыбалке

Тренды будущего: как узнать, что нас ждет через 20 лет

Самая эффективная эпиляция: выбираем лучший метод

Смена работы чаще, чем раз в год, может помешать выгодному трудоустройству

Ноу-хау, которые помогают делать улыбку идеальной

Правила секса: вопросы, которые не принято обсуждать

Мой ребенок — вундеркинд: две стороны медали

Скелет в шкафу: как искать работу после конфликтного увольнения

Проблема: частая смена работы.

Как избавиться от образа «летуна»

Время перемен: стоит ли торопиться с пластической операцией

Дело добровольное! Что надо знать о ДМС

Важные вопросы о здоровье мамы и малыша

Красивая улыбка с рождения: Почему прикус становится неправильным

Поколение Z и работа: как совместить несовместимое

Шоу Этери Тутберидзе «Чемпионы на льду» в Самаре

В самарском бассейне 18 августа определятся первые чемпионы мира по плаванию среди военных

ВК «Нова» против «Белогорье» — 1:3

Все фотогалереи

Новости раздела

  • Дарье Касаткиной присвоено звание «Заслуженный мастер спорта России»

  • Гандболистки «Лады» обыграли «Динамо-Синару» из Волгограда

  • Гандбольная «Лада» проиграла «Астраханочке»

  • Гандбольная «Лада» разгромила китайский «Феникс»

  • Волейболисты «Новы» проиграли «Кузбасу»

  • Гандболистка Юлия Какмоля после травмы вернется в команду весной

  • Гандбольная «Лада» проиграла «Университету» — 23:26

  • Тольяттинка стала победительницей V Пермского марафона

  • В последнюю неделю лета Тольятти принял сильнейших яхтсменов России

  • Дарья Касаткина потерпела поражение на старте турнира в США

  • Гандбольная «Лада» стала бронзовым призером I Всероссийской Спартакиады

  • Гандболистки «Лады» уступили Ростовской области на спартакиаде и сыграют за третье место

  • Дарья Касаткина выиграла турнир в Канаде

  • Дарья Касаткина уверенно вышла в финал турнира в Гранби

  • Гандбольная «Лада» обыграла Астраханскую область на Всероссийской Спартакиаде

  • Гандбольная «Лада» проиграла «Москве»

  • Дарья Касаткина вышла в полуфинал турнира в Канаде

  • Дарья Касаткина уверенно вышла в четвертьфинал турнира WTA-250 в Гранби

  • Гандбольная «Лада» обыграла «Ставрополье»

  • Дарья Касаткина получила уайлд-кард на турнир в канадском Гранби

  • Сборная Самарской области по гандболу обыграла Санкт-Петербург на Всероссийской Спартакиаде

  • Дарья Касаткина не смогла выйти во второй круг турнира в США

  • Гандболистка «Лады» награждена медалью ордена «За заслуги перед Отечеством» I степени.

  • Анастасия Павлюченкова приступила к тренировкам после травмы

  • Дарья Касаткина проиграла в первом круге турнира в Торонто

  • Дарья Касаткина стала победительницей турнира в Сан-Хосе

  • Самарец Александр Лифанов стал победителем международных соревнований по пятиборью «Кубок им. Павла Леднева»

  • Тольяттинец Александр Вязовкин выиграл Кубок России по гребному спорту

  • Дарья Касаткина закончила выступление на турнире в Германии

  • Дарья Касаткина вышла в четвертьфинал турнира в Германии

  • Дарья Касаткина одержала победу в первом круге турнира в Бад-Хомбурге

  • Дарья Касаткина завершила выступление на турнире в Берлине

Все новости

Индексы ВолгаНьюс

популярность

Общие Персоны Организации

неделя месяц год

    Топ 100

    Индексы ВолгаНьюс

    активность

    Общие Персоны Организации

    неделя месяц год

      Топ 100

      Архив

      ЯнварьФевральМартАпрельМайИюньИюльАвгустСентябрьОктябрьНоябрьДекабрь20222021202020192018201720162015201420132012201120102009200820072006200520042003200220012000

      Пн Вт Ср Чт Пт Сб Вс
      29 30 31 1 2 3 4
      5 6 7 8 9 10 11
      12 13 14 15 16 17 18
      19 20 21 22 23 24 25
      26 27 28 29 30 1 2

      Автомобили Lada вновь получат ABS и ESP

      Бизнес

        Главная   /   Бизнес

      Зубко Роман Юрьевич

      22. 09.2022

      «АвтоВАЗ» намерен в 2023 году возобновить производство автомобилей, оснащенных ABS, а ближе к 2024-му – машин с электронной системой стабилизации ESP.

      Об этом сообщил президент тольяттинского автогиганта Максим Соколов в рамках прошедшего в Совете Федерации совещания о развитии российского автопрома.

      Автомобили / Тесты

      Тест-драйв Lada Granta 2018: рестайлинг – пишем, новое поколение – в уме

      «В следующем году мы планируем восстановить и успеть в достаточной степени локализовать такие популярные модели, как Lada Vesta, мы планируем начать выпуск с марта следующего года, на рубеже 2022 и 2023 годов, восстановить выпуск Lada Largus. Также в начале следующего года – вернуть среди комплектаций такую функцию, – это принципиальный, ключевой момент, – как ABS», – цитирует заявление главы «АвтоВАЗа» агентство ТАСС.

      На данный момент, по его словам, в перечень оснащения вазовских машин уже вернулись кондиционер, подушки безопасности и система ЭРА-ГЛОНАСС. «Ближе к 2024 году [планируем] возврат функции ESP», – отметил М. Соколов.

      Президент «АвтоВАЗа» отметил также, что в мае 2023 года может возобновиться выпуск 16-клапанного двигателя. Что же касается более современного мотора, а также возможности освоения производства автоматических коробок передач и систем полного привода, то это, по словам М. Соколова, «возможные, но не быстро решаемые задачи, требующие серьезного финансирования».

      С 2026 года, как рассказал президент «АвтоВАЗа», предприятие намерено выйти на годовой объем производства на уровне 800 тыс. автомобилей. «Если говорить про долгосрочную перспективу, 2026 год и далее, – в планах стоит увеличение объемов выпуска до 800 тыс. автомобилей в год, при необходимости подключим площадку в Ижевске», – приводит слова М. Соколова портал Autonews.ru.

      Подпишитесь на наш канал в Яндекс.Дзен

      «Движок» теперь в Telegram! Подписывайтесь и узнавайте первыми о новинках и результатах тестов!

      372

      Новости по теме

      Бизнес / Новости

      Citroen поправил шевроны

      У компании Citroen в очередной раз сменится логотип, но на серийных машинах мы не увидим его еще почти год. В последний раз французская компания меняла логотип шесть лет назад, перейдя на двухмерный дизайн и упрощенную цветовую гамму. Однако…

      Citroen, логотип

      Бизнес / Новости

      Петербургский авторынок не спешит с восстановлением

      В августе продажи новых автомобилей в Петербурге упали на 15% относительно июля. Как следует из данных «Автостат Инфо», в августе местные дилеры реализовали 1752 новых автомобиля. Для сравнения, в июле 2022 года на территории Санкт-Петербурга…

      Санкт-Петербург, Авторынок, Статистика

      Бизнес / Новости

      Haval Jolion вписался в господдержку

      Компактный кроссовер Haval Jolion стал участником государственной программы льготного кредитования и лизинга. Это единственная иномарка, участвующая в программе. По условиям госпрограммы, льготное автокредитование распространяется на автомобили…

      Haval Jolion, господдержка, госпрограмма, Автокредитование

      Статьи по теме

      Бизнес / Статьи

      Форум IMAF 2022: автопром в эпоху кризиса

      В столичном «Экспоцентре», в рамках выставки автозапчастей и компонентов MIMS Automobility Moscow 2022, прошел XIII Международный автомобильный форум IMAF. Открывала нынешний форум пленарная дискуссия на тему «Глобальный и российский автопром:…

      IMAF, Форум, Автопром, Автобизнес

      Бизнес / Статьи

      Параллельный импорт. Хотели как лучше, а вышло?..

      В середине августа в российской столице состоялся форум «Параллельный импорт. Автомобили, запчасти, компоненты», организованный аналитическим агентством «Автостат». В его рамках эксперты и участники автомобильной отрасли обсуждали инструменты…

      Параллельный импорт, Форум, Автостат

      Бизнес / Статьи

      Константин Гуров, «Авто-Компонент»: «Легко и в короткие сроки изменить ситуацию на рынке запчастей не удастся»

      Насколько остра сегодня проблема дефицита автозапчастей в России? И как она изменилась с начала весны? С наличием каких деталей наблюдаются наибольшие трудности? Как изменились цены на запчасти и как на текущую ситуацию влияет логистика? Об…

      автозапчасти, Автокомпоненты, Рынок автозапчастей

      Акции и Скидки

      Скидки и Акции / Россия

      Jikiu запустил программу лояльности для дистрибьюторов

      Бренд Jikiu запустил программу лояльности Jikiu Money, с помощью которой дистрибьюторы могут накапливать баллы и обменивать их на подарочные сертификаты, брендированные подарки или оплату сотовой связи. Как передают представители компании,…

      JIKIU, Программа лояльности

      Скидки и Акции / Россия

      Suzuki запустил сервисную программу

      Компания «Сузуки Мотор Рус» объявила о начале действия специальной сервисной программы «Масляный сервис». Спецпредложение, как уточняют в пресс-службе компании, подразумевает комплексную услугу по замене моторного масла и действует на сервисных…

      Suzuki, Автосервис, Новости

      Скидки и Акции / Россия

      Chery запустил летнюю сервисную акцию

      Компания «Чери Автомобили Рус», официальный дистрибьютор Chery в России, объявила о запуске летней сервисной акции «С заботой о вашем Chery». В ее рамках владельцы машин марки могут провести диагностику автомобиля в официальном дилерском центре…

      Chery, сервисная акция, Новости

      Биосенсор на основе FRET для количественного определения глюкозы в культуральных супернатантах микробных культур в мл | Фабрики микробных клеток

      • Исследования
      • Открытый доступ
      • Опубликовано:
      • Юлия Оттен 1 ,
      • Никлас Тенхаеф 1 ,
      • Роман П. Янсен 1 ,
      • Johannes Döbber 1 ,
      • Lisa Jungbluth 1 ,
      • Стефан Ноак 1 ,
      • Marco Oldiges 1 ,
      • Wolfgggg wi heartememes 1 ,
      • Wolfggg wiemer. ORCID: orcid.org/0000-0001-9935-5183 1  

      Фабрики микробных клеток том 18 , Номер статьи: 143 (2019 г.) Процитировать эту статью

      • 5729 доступов

      • 12 цитирований

      • 3 Альтметрический

      • Сведения о показателях

      Abstract

      Background

      В большинстве микробных культур d-глюкоза является основным источником углерода и энергии. Однако количественное определение d-глюкозы, особенно в малых масштабах, по-прежнему является сложной задачей. Поэтому мы разработали биосенсор глюкозы на основе FRET, который можно применять в культивировании на основе микробиореактора. Этот сенсор состоит из белка, связывающего глюкозу, расположенного между двумя флуоресцентными белками, образующими пару FRET. При связывании d-глюкозы сенсор претерпевает конформационные изменения, которые транслируются в изменение отношения FRET.

      Результаты

      Выбранный датчик показывает кажущуюся K d ниже 1,5 мМ d-глюкозы и очень высокую чувствительность до 70% изменения отношения FRET между несвязанным и насыщенным глюкозой состоянием. Растворимый сенсор был успешно применен в режиме онлайн для мониторинга концентрации глюкозы в культуре Escherichia coli . Кроме того, этот датчик был использован в технологическом процессе для культуры Corynebacterium glutamicum в качестве примера процесса с клеточно-специфическим фоном (например, аутофлуоресценция) и индуцированным средой гашением. Иммобилизация датчика с помощью HaloTag ® обеспечивает очистку и ковалентную иммобилизацию в один этап и значительно повышает стабильность во время применения.

      Заключение

      Сенсор глюкозы на основе FRET использовали для количественного определения потребления d-глюкозы при культивировании на микротитрационных планшетах. Насколько нам известно, это первый описанный метод онлайн-количественного определения d-глюкозы в культивировании на основе титрационных микропланшетов. По сравнению с анализом d-глюкозы с помощью ферментативного анализа и ВЭЖХ датчик работал одинаково хорошо, но позволял проводить гораздо более быстрые измерения, что позволило значительно ускорить развитие микробного штамма.

      Исходная информация

      Несмотря на то, что с помощью микробного культивирования уже производится широкий спектр химических соединений, разработка новых процессов и штаммов для производства, например, ненатуральных ценных продуктов с использованием подходов синтетической биологии и микробных сообществ набирает обороты. В связи с этим все большее значение приобретает разработка биопроцессов в малых масштабах. Микробиореакторы позволяют ускорить разработку процесса за счет увеличения производительности, поскольку культивирование и характеристика нескольких штаммов могут быть параллельными [1]. Однако доступные микробиореакторные подходы по-прежнему охватывают ограниченное количество датчиков для онлайн-измерений, например, растворенного кислорода, биомассы, pH и флуоресценции. Дополнительные онлайн-сигналы, например, для измерения потребления источника углерода, весьма желательны для оценки скорости поглощения субстрата, которая часто коррелирует с продуктивностью.

      Несмотря на то, что ферментативные анализы обычно используются для количественного определения d-глюкозы в образцах микробных культур [2, 3], их применение в небольших масштабах по-прежнему ограничивается процессами на линии. Таким образом, образцы из соответствующих культур требуют многоэтапной процедуры обработки для обработки с помощью ферментативных анализов. Напротив, генетически закодированные датчики на основе флуоресценции, в принципе, могут использоваться в режиме онлайн, поскольку клетки могут совместно производить такие датчики, что устраняет трудоемкие операции по обработке образцов. Для обеспечения высокой пропускной способности скрининга с использованием сортировки клеток, ассоциированной с флуоресценцией (FACS), были разработаны различные сенсорные методы на основе флуоресценции [4]. Одним из вариантов являются биосенсоры на основе резонансного переноса энергии Ферстера (FRET) [5, 6], которые доступны для широкого круга малых молекул и почти исключительно используются внутриклеточно [4, 7]. В целом биосенсоры на основе FRET состоят из двух флуоресцентных зондов (донора и акцептора), слитых с центральным белком, связывающим метаболиты (BP). В оптимальных условиях FRET происходит между двумя зондами при возбуждении донора, который также передает энергию акцептору. В результате оба флуоресцентных зонда показывают разную интенсивность флуоресценции в зависимости от эффекта FRET. Этот эффект в определенном диапазоне зависит от концентрации метаболита, распознаваемого центральным связывающим белком. Из-за конформационных изменений связывающего белка эффективность FRET либо увеличивается, либо снижается. Биосенсоры, расположенные в цитоплазме клеток, ограничены в передаче качественной информации об изменении концентрации целевого метаболита внутри клетки, поскольку такие системы не могут быть должным образом откалиброваны [8]. Напротив, внеклеточное применение таких сенсоров в ферментационных бульонах клеток-продуцентов позволяет количественно определять целевой метаболит благодаря более легкой калибровке таких систем, как мы недавно продемонстрировали для L-лизина [9].].

      В настоящем исследовании мы разработали и успешно применили биосенсор на основе FRET для мониторинга d-глюкозы как источника C в экспериментах по культивированию микробов в миллилитровом масштабе. Биосенсоры были сконструированы путем слияния голубого (донор; mTurquoise2) и желтого (акцептор; Венера) варианта зеленого флуоресцентного белка (GFP) с любым концом периплазматического белка, связывающего глюкозу/галактозу (MglB) из E. coli. . MglB обладает высокой специфичностью в отношении глюкозы и галактозы [10]. Связывание этих сахаров приводит к конформационным изменениям [11], что выражается в изменении расстояния, ориентации и, следовательно, переноса энергии между флуоресцентными белками. Наша сенсорная конструкция основана на ранее описанном сенсоре глюкозы (FLII 12 P-glu600µ) [12, 13], но мы использовали mTurquoise2 и Venus в качестве FRET-пары, чтобы уменьшить влияние окружающей среды на сигнал датчика. В частности, сообщается, что интенсивность флуоресценции mTurquoise2 более стабильна и ярче даже при изменении pH и концентрации ионов [14,15,16]. Venus также проявляет пониженную чувствительность к таким изменениям по сравнению с другими желтыми вариантами GFP (YFP, Citrine) [17,18,19]. Помимо интенсивности сигнала, аффинность сенсора (K d ) должна быть адаптирована к диапазону концентраций тестируемой системы, а ее чувствительность, изменение отношения FRET между несвязанным состоянием и полностью насыщенным метаболитом состоянием, должно быть достаточно высоким, чтобы обнаруживают сигнал на фоне клеточного супернатанта.

      Оба аспекта были недавно решены путем создания набора инструментов сенсора глюкозы с использованием различных линкерных последовательностей [20]. Из этого набора инструментов был выбран датчик с гибкой последовательностью линкера (GGS) 4 между mTurquoise2 и MglB, что повысило эффективность переноса и привело к получению датчика с аффинностью в низком миллимолярном диапазоне (< 1,5 мМ; дополнительный файл 1 : рисунок S1) и очень высокой чувствительностью (~ 70% изменение коэффициента FRET). Сенсорные конструкции, использованные в данной работе, основаны на глюкозном сенсоре №. 2, разработанный ранее [20] (подробнее см. раздел «Методы» и Дополнительный файл 1).

      Растворимый Glu [-] и версия датчика глюкозы Glu [+Halo] с меткой Halo были протестированы в различных составах, чтобы продемонстрировать потенциал для количественного определения в режиме реального времени, а также для количественного определения в режиме онлайн в двух распространенных организмах на платформе. : Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli, в типичных средах культивирования CGXII и М9 соответственно. Растворимый датчик Glu [-] может надежно применяться для измерений в режиме реального времени, демонстрируя потенциал датчиков на основе FRET для разработки технологических процессов. Кроме того, мы разработали простую стратегию, обеспечивающую очистку, иммобилизацию и, что наиболее важно, также стабилизацию сенсора с помощью HaloTag 9.0014 ® [21, 22], что позволило использовать иммобилизованный сенсор Glu [+Halo] в режиме онлайн в условиях культивирования. Насколько нам известно, это первый раз, когда биосенсор на основе FRET использовался для онлайн-обнаружения глюкозы при культивировании в миллилитровом масштабе.

      Методы

      Белковый дизайн

      Биосенсор без HaloTag ® (Glu [-] ), используемый в этом исследовании, основан на сенсоре №. 2 в недавней публикации [20] с модификацией гексагистидиновой метки (His-tag). В отличие от датчика №. 2 His-метка была перемещена на С-конец белка с помощью ПЦР с удлинением с перекрытием [23]. Кроме того, центральный MglB несет замену L238M для снижения сродства к глюкозе [24]. His-метка биосенсора с HaloTag ® (Glu [+Halo] ) оставался на N-конце, в то время как последовательность HaloTag ® была слита с С-концом посредством сборки Gibson с использованием комплекта сборки NEB Gibson [22, 25]. Последовательности ДНК, белковые последовательности и праймеры см. в дополнительном файле 1.

      Производство и очистка сенсора

      Для производства обоих вариантов сенсора (Glu [-] и Glu [+Halo] ) химически компетентный E. coli Клетки BL21(DE3) трансформировали плазмидами, кодирующими соответствующий вариант сенсора [26]. Трансформированные клетки выращивали в течение ночи на чашках с LB-агаром, содержащих 100 мг мл -1 ампициллин. Одну колонию использовали для инокуляции 20 мл среды LB и выращивали в течение ночи при 37 °C. Для посева основной культуры (1 л) в среду для аутоиндукции использовали 1 мл этой прекультуры [27]. Клетки выращивали в течение 2 ч при 37 °C и дополнительно 70 ч при 20 °C при 150 об/мин в 2-литровых колбах с перегородками (400 мл). Клетки собирали центрифугированием и хранили при - 20 °C до дальнейшего использования. Для очистки сенсора 10% (мас./об.) клеток суспендировали в буфере (20 мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, pH 7,3) и разрушали с помощью гомогенизации под высоким давлением в трех пассажах с использованием Avetin Emulsiflex-C5 (Avestin Europe GmbH, Мангейм, Германия). Очистку проводили с помощью His-tag с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Qiagen, Hilden, Germany) с последующей эксклюзионной хроматографией, как описано ранее [9].]. Наконец, датчик концентрировали до 20 мкМ посредством ультрафильтрации (ультрацентробежный фильтр Amicon, отсечка 30 кДа) (Merck Millipore, Дармштадт, Германия) и хранили в 20 мМ буфере MOPS, pH 7,3, при - 20 °C.

      Определение белка

      Концентрацию белка растворимого сенсора измеряли фотометрически с использованием молярного коэффициента экстинкции Венеры (ε 515 нм  = 92 200 моль -1 см -1 ) [18].

      Калибровка/привязка изотерм

      Изотермы связывания и калибровку для процесса at-line регистрировали в микротитрационном планшете с использованием 50 мкл растворимого сенсора (2 мкМ), который смешивали с 50 мкл буфера MOPS (20 мМ, рН 7,3), содержащего d-глюкозу в диапазоне от 0 мМ до 1000 мМ. Измерения проводили на микротитрационном спектрофлуориметре (M-200 или M-1000, Tecan, Männedorf, Швейцария) при комнатной температуре. Изотермы связывания с различным содержанием среды либо CGXII-, либо M9-среды регистрировали при концентрациях среды в диапазоне от 2,5 до 90% (об./об.) путем замены соответствующего объема буфера MOPS. Для каждого измерения рассчитывали среднее арифметическое 10 циклов измерений [8]. mTurquoise2 возбуждался при 428 ± 20 нм, соответствующее излучение обоих FRET-партнеров регистрировалось при 485 ± 20 нм для mTurquoise2 [14] и 528 ± 20 нм для Венеры [18]. Отношение FRET R рассчитывали как интенсивность флуоресценции акцептора, деленную на интенсивность донора, согласно уравнению. (1).

      $$R = \frac{{I_{акцептор} }}{{I_{донор} }}$$

      (1)

      Параметры изотерм связывания были получены путем подгонки данных с использованием следующего уравнения. (2) [28]:

      $$R = \frac{{\Delta R_{{}} *\left[ S \right]}}{{K_{d} + \left[ S \right]}} + R_{0}$$

      (2)

      are R 0 описывает отношение FRET в отсутствие d-глюкозы, ΔR (R sat – R 0 ) относится к чувствительности сенсора, максимальное изменение FRET-коэффициента при насыщении сенсора глюкозой (R sat ), а константа диссоциации K d , которая описывает кажущееся сродство сенсора, выводится при полумаксимальном насыщении из точки перегиба изотермы связывания. Нормализованный ΔR определяли как ΔR/R 0 *100%. Кроме того, динамический диапазон датчика может быть получен из квазилинейной области в полулогарифмическом представлении изотермы связывания (см. Дополнительный файл 1: рисунок S1). Изотермы связывания регистрировали на приборах разного разрешения и чувствительности, таких как планшетные ридеры (Tecan M-1000, Tecan M-200) и микробиореактор BioLector 9. 0014 ® (m2p labs, Baesweiler, Германия). В результате вычисленное кажущееся сродство сенсора варьировалось в диапазоне от 0,4 до 1,5 мМ в зависимости от используемого устройства. Поэтому калибровки, используемые для дальнейшего расчета концентрации d-глюкозы в культуральной жидкости, всегда выполнялись на одном и том же устройстве в тех же условиях, что и соответствующие эксперименты.

      Измерения стабильности

      Измерения термостабильности проводились путем инкубации сенсоров Glu [-] (2 мкМ) и Glu [+Halo] (иммобилизованный) в MOPS-буфере (20 мМ, рН 7,3) при разных температурах (25 °С, 4 °С и - 20 °С). Измерения проводили на спектрофотометре Tecan M-200. После возбуждения донора mTurquoise2 при λ ex 420 ± 9 нм регулярно регистрировали спектры излучения от λ em 460 нм до 650 нм, чтобы проследить возможное снижение интенсивности флуоресценции. Из этих спектров был рассчитан коэффициент FRET при максимальном излучении mTurquoise2 и Венеры в соответствии с формулой. (1). Кроме того, SDS-PAGE был выполнен с использованием 190,5 мкл соответствующего образца сенсора, 7,5 мкл восстановителя образца NuPAGE ® (10×) и 3 мкл буфера для образца NuPage ® SDS (4×) (ThermoFischer Nunc, Уолтем, Массачусетс, США). В качестве маркера мы использовали гели NuPage ® 4–12% Bis-TRIS толщиной 1 мм (ThermoFischer Nunc, Уолтем, Массачусетс, США) и Prestained Protein Ladder PageRuler Plus (ThermoFischer Nunc, Уолтем, Массачусетс, США). Гели запускали при 200 В в течение 45 мин [29].

      Измерения для определения устойчивости к встряхиванию проводились в чашке для цветов в BioLector ® (m2p labs, Baesweiler, Германия). Здесь 50 мкл сенсоров Glu [-] (2 мкМ) и Glu [+Halo] (иммобилизованных) смешивали с 750 мкл буфера MOPS (20 мМ, pH 7,3) или среды M9 соответственно. Флуоресцентное излучение mTurquoise2 (λ em  = 486 ± 5 нм) и Венеры (λ em  = 532 ± 5 нм) измеряли после возбуждения при λ ex  5 n= 430 .

      Текущий анализ

      Калибровка моделей растворимых датчиков (Glu [-] ) для оперативного анализа выполняли, как описано выше. Чтобы имитировать условия процесса, C. glutamicum ATCC 13032 выращивали в течение ночи в среде CGXII при 30 °C [30, 31], содержащей фруктозу (20 г л -1 , 112 мМ) в качестве основного источника C. Образец клеточной суспензии (15 мкл) разводили 285 мкл буфера MOPS (20 мМ, рН 7,3), содержащего глюкозу в диапазоне концентраций от 0 г л -1 до 45 г л -1 (250 мМ). . Из этих разведенных образцов 50 мкл смешивали с Glu 9.0014 [-] раствор (50 мкл, 2 мкМ) в прозрачных титрационных микропланшетах объемом 300 мкл (ThermoFischer Nunc, Уолтем, Массачусетс, США). Калибровка выполнялась в квадруплете.

      Непрерывный процесс и анализ проводились на специально разработанной роботизированной пипеточной платформе Tecan Freedom EVO200 (Tecan, Männedorf, Швейцария) со встроенным BioLector ® , центрифугой (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Остероде-ам-Харц, Германия) и спектрофлуориметром. (Текан М-200) [3]. Для культивирования C. glutamicum ATCC 13032 инкубировали в 1000 мкл среды CGXII, содержащей d-глюкозу (20 г л -1 ), в 48-луночных цветочных планшетах (m2p-labs GmbH, Baesweiler, Германия) при 1400 об/мин и 30 °C. Каждый час отбирали пробы из трех лунок, и для оперативного анализа d-глюкозы использовали технический дубликат объемом 15 мкл соответственно. Оставшийся материал центрифугировали для удаления клеток, а супернатант хранили при 4 °C для сравнительного автономного анализа с помощью ВЭЖХ и ферментативного анализа d-глюкозы, как описано ранее [2]. Во время культивирования pH, pO 2 , и образование биомассы (измеренное как рассеянный свет на 620 нм, называемый «обратным рассеянием») регистрировались в режиме онлайн с помощью BioLector ® .

      Иммобилизация датчика

      Иммобилизация датчика Glu [+Halo] выполнялась при комнатной температуре. Перед использованием смолу Halo-Link ® (размер частиц = 45–165 мкм, Promega, Мангейм, Германия) дважды промывали буфером MOPS (20 мМ, pH 7,3). Суспензию смолы (100 мкл) инкубировали с 1 мл Glu 9.Раствор 0014 [+Halo] (20 мкМ) в течение 1 ч в пробирке Эппендорфа на 1,5 мл при постоянном медленном переворачивании. После центрифугирования в настольной центрифуге (10 с, 2000× г , миницентрифуга Sprout, Biozym, Hessisch Oldendorf, Германия) супернатант удаляли. После этого смолу дважды промывали 20 мМ буфером MOPS. Иммобилизованный датчик Glu [+Halo] хранили при 4 °C во взвешенном состоянии в буфере MOPS (20% об./об.) в темноте. Нагрузку шариков датчиком оценивали, сравнивая поглощение Венеры (λ ex  = 515 нм, ε = 92 200 M -1 см -1 ) раствора сенсора до и после иммобилизации.

      Онлайн-анализ

      Онлайн-анализ концентрации глюкозы выполняли с помощью иммобилизованного датчика Glu [+Halo] в BioLector ® . E. coli K12 MG1655 культивировали в 750 мкл среды M9 (модифицированной из [32]), содержащей 5 г л -1 (28 мМ) d-глюкозы, при 900 об/мин и 30 °C. Иммобилизованный биосенсор (50 мкл суспензии (20% об./об.) в буфере MOPS (20 мМ, рН 7,3) добавляли в один ряд лунок 48-луночного цветочного планшета (m2p labs, Baesweiler, Германия). концентрация биомассы (измеряемая как рассеянный свет с длиной волны 620 нм, называемая «обратным рассеянием»), а также два флуоресцентных сигнала (λ ex  = 430 ± 5 нм, λ em  = 486 ± 5 нм и λ em  = 532 ± 5 нм) были зарегистрированы в BioLector® 54 . Стандарты концентрации d-глюкозы для онлайн-калибровки готовили путем смешивания среды M9 (750 мкл) с 20 концентрациями в диапазоне от 0 мМ до 100 мМ (от 0 г л -1 до 18 г л -1 ) d-глюкозы с 50 мкл суспензии сенсорных шариков на той же пластине. Калибровочная кривая описывается кинетическим уравнением насыщения, параметры которого подгоняются к измеренным данным калибровки путем минимизации суммы квадратов (дополнительный файл 1: рисунок S9).).

      Перед онлайн-анализом d-глюкозы мы более подробно отслеживали рост E. coli MG1655 в описанных условиях процесса, а также в присутствии иммобилизованного Glu [+Halo] , чтобы исключить ограничения роста. Таким образом, в дополнение к обратному рассеянию и двум флуоресцентным сигналам pH и pO 2 были перекодированы в режиме онлайн с помощью BioLector ® . Полученные данные показаны в дополнительном файле 1: рисунок S10.

      Результаты и обсуждение

      Характеристика сенсора

      Концентрация d-глюкозы в микробных культурах обычно находится в диапазоне от 0 до 200 мМ, что требует сравнительно низкой аффинности сенсора d-глюкозы в нижнем миллимолярном диапазоне для обнаружения истощения d-глюкозы. Первый вариант растворимого сенсора, Glu [-] , изученный в этой работе, показывает значения K d 0,4 ± 0,1 мМ для d-глюкозы и очень хорошую чувствительность в буфере, как можно вывести из отношения FRET. изменение (ΔR) на 75% между несвязанным и связанным состоянием (дополнительный файл 1: рисунок S1). Таким образом, диапазон обнаружения в буфере MOPS составляет от 0,01 мМ до 10 мМ (0,0018 г л -1 до 1,8 г л -1 ) d-глюкозы.

      Помимо высокой интенсивности сигнала датчик также должен быть стабильным в условиях, применяемых в микробиореакторе, где биосенсор подвергается воздействию температуры и механических нагрузок при встряхивании. Во-первых, термостабильность растворимого сенсора Glu [-] была протестирована в отношении его стабильности при различных температурах. Хотя коэффициент FRET в присутствии и в отсутствие d-глюкозы оставался стабильным в течение 21 дня инкубации при 4 °C и - 20 °C соответственно, коэффициент FRET уже явно изменился через 3 дня при 25 °C (рис. . 1а), что явно ограничивает применимость этого датчика при комнатной температуре. Таким образом, сеньор подходит для применения в лабораторных масштабах со временем культивирования в диапазоне от 24 до 48 часов. Анализ SDS-PAGE показал, что наблюдаемая нестабильность вызвана главным образом усиливающейся деградацией слитого белка (рис. 1b). Белок биосенсора распадается на фрагменты размером около 30 кДа (рис. 1b, красная рамка), что соответствует размерам как FP, так и центрального MglB соответственно. Аналогичные результаты были получены и ранее при попытках кристаллизации различных подобных сенсоров (данные не показаны). Однако основной механизм еще предстоит выяснить.

      Рис. 1

      Стабильность датчика Glu [-] (20 мкМ) в буфере MOPS (20 мМ, pH 7,3) при 25 °C. a FRET-коэффициент датчика Glu [-] , показывающий явные признаки деградации после инкубации в течение 3 дней. b SDS-PAGE анализ датчика Glu [-] . Этикетки над дорожками отмечают количество дней инкубации. Размер полноразмерного белка составляет  ~ 90 кДа (зеленая рамка). Через 2 дня при 25 °C сенсор начинает разлагаться на более мелкие фрагменты  ~ 60 кДа (оранжевый прямоугольник, дорожка 3) и  ~ 25–30 кДа (красный прямоугольник). Через 4 дня (дорожки 4–11) сенсор полностью разлагается на фрагмент  ~ 25–30 кДа (подробности см. в тексте)

      Изображение в натуральную величину

      Помимо температуры, датчик должен быть устойчив также к различным средам культивирования. Чтобы тщательно протестировать применение нового сенсора d-глюкозы для применения с Corynebacterium glutamicum , среду CGXII тестировали как типичную среду для культивирования [30] на предмет влияния на свойства сенсора. Соответствующая изотерма связывания датчика Glu [-] , зарегистрированная в присутствии культуральной среды, демонстрирует сильное влияние среды CGXII на чувствительность датчика по отношению к буферу (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S2). Из-за сильного фона и гашения среды CGXII измерения целесообразны только со средой CGXII, разбавленной не менее чем на 95% буфер (об./об.). Кроме того, это разведение позволяет проводить измерения в присутствии клеток C. glutamicum . Таким образом, разделение клеток перед измерением уровня d-глюкозы не требуется. К счастью, среда не повлияла на кажущийся K d сенсорного варианта, что указывает на то, что эффект тушения среды влияет на флуоресцентные белки, а не на MglB (дополнительный файл 1: рисунок S2). Пределы обнаружения от 0,01 мМ до 10 мМ (от 0,0018 г л -1 до 1,8 г л -1 ) d-глюкоза, однако, может быть изменена путем разбавления образцов культивирования. Разбавление в 40 раз позволило бы количественно определить d-глюкозу от 0,4 мМ до 400 мМ (от 0,072 до 72 г л -1 ), что охватывает диапазон концентраций большинства микробных культур.

      Еще одной предпосылкой для применения таких датчиков является воспроизводимость калибровок во время типичного эксперимента по культивированию, что указывает на их стабильность в условиях процесса. Повторные сравнительные калибровки в буфере MOPS в присутствии и в отсутствие среды CGXII (2,5% об./об., разведение 1:40) не показали существенного влияния на кажущуюся аффинность (К d ) и интенсивность сигнала датчика Glu [-] . Как показано на рис. 2, изотермы связывания оставались стабильными на протяжении всего эксперимента, что свидетельствует о том, что этот датчик можно использовать для повторных измерений.

      Рис. 2

      Изотерма связывания биосенсора Glu [-] либо в MOPS (20 мМ, pH 7,3), либо ( a ) со средой CGXII (2,5% об/об) и ( b ) без добавление среды без встряхивания. FRET-отношение (I A /I D ) рассчитывали по излучению донора mTurquoise2 на 485 нм (± 20 нм) и акцептора Венеры на 528 нм (± 20 нм) после возбуждения донора на 428 нм (± 9 нм) в соответствии с уравнением (1). Между измерениями датчик хранили в защищенном от света месте при 4 °C. Кривые (пунктирные) были приспособлены к данным в соответствии с формулой. (2)

      Полноразмерное изображение

      Помимо термического разложения и эффектов среды, также тряска датчика Glu [-] в цветочных пластинах ® устройства BioLector ® оказался вредным, поскольку эмиссия обоих FRET-партнеров значительно уменьшилась (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S5). Снижение обеих интенсивностей излучения свидетельствует о деградации как минимум донора, а скорее всего и акцептора. Кроме того, частота встряхивания > 800 об/мин приводила к агрегации датчика Glu [-] (данные не показаны). Агрегированный сенсор больше не реагировал на изменения концентрации d-глюкозы, в результате чего Glu [-] Датчик не подходит для онлайн-приложения во встряхиваемых культурах. Однако растворимый датчик Glu [-] можно применять в автоматизированном процессе для измерения d-глюкозы на линии. В таких условиях запас биосенсоров можно легко хранить при температуре 4 °C между измерениями, что резко увеличивает срок его службы. Кроме того, датчик Glu [-] не подвергается тряске, что способствует его стабильности.

      Применение растворимого Glu 9 в процессе эксплуатации0014 [-] Сенсор

      Имея под рукой достаточно стабильный сенсор и воспроизводимую калибровку, был создан оперативный протокол количественного определения d-глюкозы для широко используемого производственного штамма Corynebacterium glutamicum (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S7). Во время культивирования C. glutamicum ATCC 13032 в BioLector ® рост биомассы, потребление кислорода и изменения рН контролировали в режиме онлайн. Как описано в разделе «Методы», каждый час с помощью системы обработки жидкостей отбирали три образца, разбавляли и измеряли концентрацию d-глюкозы с помощью Glu 9.0014 [-] биосенсор (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S8 для калибровки). Супернатант остальных образцов хранили при 4 °C для сравнительного автономного анализа с использованием ВЭЖХ и ферментативного анализа d-глюкозы [2].

      Как показано на рис. 3, сенсорный анализ Glu [-] показал очень хорошие результаты и показал потребление d-глюкозы в соответствии с анализами ВЭЖХ и ферментативного анализа. Примечательно, что измерение проводилось в присутствии бактериальных клеток с использованием небольшого количества образца (15 мкл) и очень короткого времени инкубации (< 1 мин). Эти свойства облегчают процесс измерения, и, таким образом, наш рабочий процесс позволяет проводить количественную оценку d-глюкозы в большом количестве образцов во время выполнения процесса культивирования.

      Рис. 3

      Рост биомассы ( a ) и потребление d-глюкозы C. glutamicum ATCC 13032 в среде CGXII с последующим использованием ( b ) датчика Glu [-05

    • 9 c
    • 5 ферментативный анализ d-глюкозы и ( d ) анализ ВЭЖХ. В то время как сенсорный анализ можно было проводить в режиме реального времени, ферментативный анализ и ВЭЖХ проводили в автономном режиме после окончания культивирования. Каждая кривая напоминает биологическую реплику. Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD) в трех технических повторностях

      Изображение полного размера

      Ферментативный анализ обычно используется для количественного определения d-глюкозы в образцах микробных культур [2, 3], а также может использоваться в автоматизированной поточной установке [33]. Однако есть и ярко выраженные недостатки: во-первых, они требуют предварительного отделения бактериальных клеток, часто с помощью центрифугирования или фильтрации. Это усложняет рабочий процесс, отнимает больше времени и требует сложной платформы для работы с жидкостями. Напротив, анализ сенсора d-глюкозы требует только этапов разбавления, которые можно быстро выполнить с помощью стандартных операций с жидкостями. Во-вторых, ферментативные анализы включают этапы инкубации от 10 минут [34] до 30 минут [2]. Хотя этот трудоемкий шаг не вызывает проблем при параллельной обработке большого количества образцов, он ограничивает интервал измерений в режиме реального времени. Например, предыдущее исследование продемонстрировало измерения d-глюкозы в режиме реального времени с помощью ферментативного анализа с интервалом 80 минут [33]. Глю 9Биосенсор 0014 [-] , с другой стороны, немедленно реагирует на d-глюкозу в окружающей среде, а также в присутствии клеток, что открывает путь к очень коротким циклам измерений и, таким образом, увеличивает плотность данных.

      Насколько нам известно, в настоящее время не существует установленного метода ВЭЖХ на линии для микробиореакторов из-за длительного времени удерживания и иногда сложной подготовки образцов [35]. В то время как подготовка проб путем фильтрации может быть легко автоматизирована, недостаток измерения только одной пробы за раз серьезно затрудняет применение методов ВЭЖХ на линии при культивировании в микробиореакторе, которое часто включает несколько параллельных культиваций. Однако преимущества хроматографических методов заключаются в измерении нескольких аналитов за один цикл.

      Иммобилизация

      После успешной настройки протокола оперативных измерений в среде CGXII мы направились к приложению для онлайн-измерений. Как показано выше, растворимый датчик Glu [-] не обладает долговременной стабильностью при температурах выше 25 °C и подвержен механическому воздействию. Нельзя избежать механического стресса, так как перемешивание необходимо для любого микробного культивирования, чтобы обеспечить достаточное перемешивание и, в случае аэробного культивирования, перенос кислорода. Таким образом, стабильность датчика должна быть улучшена. Первоначальные исследования иммобилизации с помощью His-метки не увенчались успехом, поскольку Co 2+ -хелатная связь с гранулами диоксида кремния, функционализированными нитрилотриуксусной кислотой (Dynabeads, ThermoScientific), не была стабильной в условиях процесса (данные не показаны). Альтернативным подходом является иммобилизация с помощью HaloTag ® [21], который обеспечивает ковалентную иммобилизацию и очистку в одну стадию, начиная также непосредственно с сырых клеточных экстрактов, как это недавно было успешно продемонстрировано для иммобилизации различных ферментов [22, 36, 37]. ].

      Слияние HaloTag ® к С-концу сенсора d-глюкозы приводил к сенсору Glu [+Halo] . Это слияние уменьшило общий коэффициент FRET, а также ΔR в растворе с 75% до почти 40% по сравнению с датчиком Glu [-] . Однако после иммобилизации датчик Glu [+Halo] восстанавливает функциональность и высокую интенсивность сигнала (ΔR 74%) датчика Glu [-] (подробнее см. Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Этот удивительный результат можно объяснить следующим образом: как мы показали ранее, эффективность FRET (интенсивность сигнала) сильно зависит от расстояния и гибкости донорского FP mTurquoise2 по отношению к центральному белку, связывающему глюкозу (MglB) [20]. Из-за схожего размера FP и HaloTag ® (около 30 кДа), нельзя исключить отрицательные стерические эффекты С-концевого HaloTag ® в составе растворимого сенсора, что могло бы объяснить снижение общей эффективности переноса, как показано в спектрах излучения (рис. 4). Здесь снижение эффективности переноса отражается в уменьшении излучения акцепторной Венеры после возбуждения донора mTurquoise2 (λ ex  = 425 ± 9 нм). Поскольку HaloTag ® расположен на С-конце сенсора, белок, вероятно, деформирован, тем самым изменяя расстояние и/или ориентацию между донором и акцептором. Иммобилизация на поверхности Sepharose 9Бусины 0014® предположительно уменьшают взаимодействие HaloTag ® с партнерами FRET, что приводит к восстановлению функциональности. Примечательно, что на сродство (K d ) сенсора не влияет ни добавление метки, ни иммобилизация. В растворимом составе, а также в иммобилизованной форме аффинность оставалась в том же диапазоне (0,8 мМ ± 0,2 мМ), что свидетельствует о том, что HaloTag ® не влияет на сайт связывания d-глюкозы (дополнительный файл 1: рисунок С1).

      Рис. 4

      Спектры излучения датчика Glu [+Halo] ( a ), не иммобилизованного и ( b ), иммобилизованного на смоле HaloLink ® . Спектры были получены после возбуждения FRET-донора mTurquoise2 при λ ex  = 425 нм (± 9 нм) в присутствии (черная кривая) и в отсутствие (серая кривая) 1 M d-глюкозы. Интенсивность нормализована к излучению на длине волны 485 нм (λ em м, бирюзовый2)

      Полноразмерное изображение

      По сравнению с другими методами иммобилизации для таких датчиков, такими как инкапсуляция, сайт-ориентированная иммобилизация с помощью HaloTag ® лучше, так как ни гибкость, ни доступность иммобилизованного датчика не ухудшаются. В предыдущем исследовании аналогичный датчик d-глюкозы на основе FRET был инкапсулирован в частицы кремнезема, что значительно снизило интенсивность FRET [38]. Кроме того, биосенсор можно иммобилизовать непосредственно из неочищенного клеточного экстракта, что позволяет избежать трудоемкой и дорогостоящей хроматографической очистки белка [39].

      Онлайн-приложение иммобилизованного Glu

      [+Halo] 9Сенсор 0015

      При ковалентной иммобилизации сенсора Glu [+Halo] на поверхности гранул Sepharose ® устойчивость сенсора к механическим воздействиям была значительно повышена, что было необходимым условием для применения этих гранул непосредственно в микробиологических культивирование (дополнительный файл 1: рисунок S6). В то время как иммобилизация решает проблемы стабильности, гашение среды CGXII остается. Кроме того, увеличение концентрации C. glutamicum также приводит к увеличению фона из-за аутофлуоресценции [40]. Чтобы преодолеть это, иммобилизованный Glu 9Сенсор 0014 [+Halo] тестировали в среде M9, типичной среде для культивирования Escherichia coli [32]. Несмотря на снижение ΔR до 35%, изменение коэффициента FRET заметно (см. Дополнительный файл 1: рисунок S3). Как следствие, измерения в среде М9 можно было проводить с помощью датчика непосредственно в культивируемом пространстве, что облегчает онлайн-приложение.

      Результаты онлайн-аппликации иммобилизованного сенсора Glu [+Halo] при культивировании E. coli K12 MG1655 в среде M9 показаны на рис. 5. На протяжении всего культивирования оба флуоресцентных сигнала сенсора контролировались с помощью BioLector ® и FRET-коэффициента (I A / I D ) был рассчитан. Затем рассчитывали внеклеточную концентрацию d-глюкозы на основе отношения FRET и калибровки иммобилизованного датчика Glu [+Halo] в той же среде в той же цветочной пластине (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S9 для калибровки). . За потреблением d-глюкозы можно было следить на протяжении всего эксперимента по культивированию (20 ч). Здесь Glu 9Сенсор 0014 [+Halo] имел диапазон обнаружения от 0,02 до 2 мМ (от 0,0036 до 0,36 г л -1 ). В соответствии с этим диапазоном, при истощении запасов d-глюкозы (через 18 ч) дальнейшее изменение FRET-сигнала обнаружить не удалось. Несмотря на то, что в среде не осталось d-глюкозы, биомасса продолжала увеличиваться, предположительно в результате избыточного метаболизма [41].

      Рис. 5

      Коэффициент FRET ( a ), истощение запасов глюкозы ( b ) и рост биомассы ( c ) в Культивирование E. coli в среде M9, измеренное с помощью биосенсора на основе FRET, иммобилизованного на смоле HaloLink ® . Соотношение FRET использовалось для расчета текущей концентрации d-глюкозы на основе калибровки иммобилизованного датчика (см. Дополнительный файл 1: рисунок S9)

      Полноразмерное изображение

      быть ограниченным определенным окном измерения, определяемым динамическим диапазоном датчика. В отличие от непрерывных измерений, где конечная концентрация d-глюкозы в образцах может быть адаптирована к аффинности сенсора, для онлайн-измерений требуются либо сенсоры с более широким динамическим диапазоном, либо другие сенсоры с соответствующей аффинностью, чтобы охватить более широкий диапазон концентраций целевого метаболита. . Аффинность сенсора d-глюкозы можно регулировать либо соответствующей аминокислотной заменой в глюкозосвязывающих белках [24, 42, 43], выбором альтернативных глюкозосвязывающих белков с более низкой аффинностью [44, 45], либо вставкой линкера последовательности [9, 20]. Поскольку до сих пор не известно ни одного датчика на основе FRET с очень широким диапазоном обнаружения [7], можно было бы рассмотреть возможность комбинации нескольких датчиков d-глюкозы с разным сродством и FRET-пар, иммобилизованных на одном носителе, для расширения диапазона обнаружения.

      Заключение

      Мы успешно использовали растворимый и иммобилизованный биосенсор d-глюкозы на основе FRET для мониторинга потребления d-глюкозы в небольших микробных культурах на примере двух распространенных штаммов-продуцентов: C. glutamicum и E. coli .

      Мы предложили непрерывный процесс с использованием растворимого биосенсора Glu [-] . Эта установка показала хорошие результаты по сравнению с общепринятыми автономными методами, такими как ВЭЖХ и ферментативное количественное определение d-глюкозы. Благодаря использованию автоматизированного процесса отбора проб и этапов разбавления динамический диапазон датчика Glu [-] был увеличен в 40 раз до 0,4–400 мМ (от 0,072 до 72 г л -1 ), а эффекты гашения мультимедийные компоненты были уменьшены. Представленный датчик сохранил очень высокую чувствительность при изменении коэффициента FRET ~ 60%.

      Ковалентная иммобилизация варианта сенсора с помощью HaloTag ® , Glu [+Halo] на гранулах Sepharose ® повысила устойчивость к механическим нагрузкам, сохранив кажущееся сродство (~ 0,8 мМ) и чувствительность растворимого Датчик Glu [−] . Затем иммобилизованный датчик был успешно использован в микробиореакторе для обнаружения потребления d-глюкозы в режиме онлайн. До сих пор никакая другая прямая количественная оценка d-глюкозы в небольших устройствах для культивирования невозможна. Несмотря на низкую дальность обнаружения сенсора, иммобилизованный Glu [+Halo] можно использовать для онлайн-обнаружения и контроля d-глюкозы в обычно ограниченных по углероду экспериментах с периодической подпиткой в ​​миллилитровом масштабе.

      Для дальнейшего изучения применимости иммобилизованного датчика d-глюкозы его также можно использовать в предлагаемом технологическом процессе. Это расширит диапазон обнаруживаемых концентраций и позволит использовать его также в средах с сильным фоном, поскольку культуральный супернатант может быть разбавлен. Для утилизации иммобилизованного датчика магнитные частицы были бы лучшим вариантом, так как они уже доступны с модификацией поверхности для HaloTag 9.Система 0014 ® . Здесь магнитное удержание шариков позволяет промывать и восстанавливать датчик.

      В заключение, биосенсоры на основе FRET теперь готовы к использованию для количественного определения метаболитов в культуральных супернатантах. Принимая во внимание огромное разнообразие периплазматических связывающих белков [7, 42, 46], диапазон доступных пар FRET [47] и уже доступные наборы инструментов для линкеров [9, 20], такие биосенсоры могут быть адаптированы для соответствующего приложения для стимулирования штаммов и процессов. развития синтетической биологии.

      Доступность данных и материалов

      Наборы данных, использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

      Ссылки

      1. Hemmerich J, Noack S, Wiechert W, Oldiges M. Микробиореакторные системы для ускоренной разработки биопроцессов. Biotechnol J. 2018. https://doi.org/10.1002/biot.201700141.

        Артикул пабмед Google ученый

      2. Унтан С., Радек А., Вихерт В., Олдигес М., Ноак С. Автоматизация биопроцессов на мини-пилотной установке позволяет быстро проводить количественное микробное фенотипирование. Факт микробной клетки. 2015. https://doi.org/10.1186/s12934-015-0216-6.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      3. Hemmerich J, Tenhaef N, Steffens C, Kappelmann J, Weiske M, Reich SJ, et al. Меньше жертв, больше понимания: повторные отборы небольших объемов культур в микробиореакторе позволяют ускорить глубокое фенотипирование библиотек микробных штаммов. Biotechnol J. 2018. https://doi.org/10.1002/biot.201800428.

        Артикул пабмед Google ученый

      4. Чжан Дж., Дженсен М.К., Кислинг Д.Д. Разработка биосенсоров и их применение в метаболической инженерии. Curr Opin Chem Biol. 2015. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2015.05.013.

        Артикул пабмед Google ученый

      5. Carlson HJ, Campbell RE. Генетически закодированные биосенсоры на основе FRET для многопараметрической флуоресцентной визуализации. Курр Опин Биотехнолог. 2009 г.;20(1):19–27.

        КАС Статья Google ученый

      6. Мохсин М., Ахмад А., Икбал М. Генетически кодируемые датчики на основе FRET для количественного мониторинга метаболитов. Биотехнологическая лат. 2015. https://doi.org/10.1007/s10529-015-1873-6.

        Артикул пабмед Google ученый

      7. «>

        Сэнфорд Л., Палмер А. Последние достижения в разработке генетически кодируемых флуоресцентных датчиков. В: Методы в энзимологии. 1-е изд. Амстердам: Elsevier Inc .; 2017. с. 1–49. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2017.01.019.

        Google ученый

      8. Moussa R, Baierl A, Steffen V, Kubitzki T, Wiechert W, Pohl M. Оценка генетически закодированных биосенсоров на основе FRET для количественного анализа метаболитов in vivo. Дж Биотехнолог. 2014. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.07.007.

        Артикул пабмед Google ученый

      9. Штеффен В., Оттен Дж., Энгельманн С., Радек А., Лимберг М., Кениг Б. и др. Набор инструментов генетически закодированных биосенсоров на основе FRET для быстрого анализа l-лизина. Датчики. 2016. https://doi.org/10.3390/s16101604.

        Артикул пабмед Google ученый

      10. «>

        Vyas N, Vyas M, Quiocho F. Сайты связывания сахара и преобразователя сигнала белка хеморецептора галактозы Escherichia coli . Наука. 1988; 1:1. https://doi.org/10.1126/science.3057628.

        Артикул Google ученый

      11. Боррок М.Дж., Кисслинг Л.Л., Форест К.Т. Конформационные изменения белка, связывающего глюкозу / галактозу, освещенные открытыми, нелигандными и связанными с лигандом структурами сверхвысокого разрешения. Белковая наука. 2007 г. https://doi.org/10.1110/ps.062707807.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      12. Дойшле К., Окумото С., Фер М., Лугер Л.Л., Кожух Л., Фроммер В.Б. Создание и оптимизация семейства генетически кодируемых сенсоров метаболитов с помощью полурациональной белковой инженерии. Белковая наука. 2005. https://doi.org/10.1110/ps.051508105.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      13. «>

        Фер М., Окумото С., Дойшле К., Лагер И., Лугер Л.Л., Перссон Дж. и др. Разработка и использование флуоресцентных наносенсоров для визуализации метаболитов в живых клетках. Биохим Сок Транс. 2005 г. https://doi.org/10.1042/BST0330287.

        Артикул пабмед Google ученый

      14. Goedhart J, von Stetten D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA, et al. Структурно-управляемая эволюция голубых флуоресцентных белков с квантовым выходом 93%. Нац коммун. 2012. https://doi.org/10.1038/ncomms1738.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      15. Баджар Б., Ван Э., Чжан С., Лин М., Чу Дж. Руководство по парам FRET флуоресцентных белков. Датчики. 2016. https://doi.org/10.3390/s160

        .

        Артикул пабмед Google ученый

      16. «>

        Markwardt ML, Kremers G-J, Kraft CA, Ray K, Cranfill PJC, Wilson KA, et al. Улучшенный лазурный флуоресцентный белок с повышенной яркостью и уменьшенным обратимым фотопереключением. ПЛОС ОДИН. 2011. https://doi.org/10.1371/journal.pone.001789.6.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      17. Рекас А., Алаттиа Дж.-Р., Нагаи Т., Мияваки А., Икура М. Кристаллическая структура Венеры, желтого флуоресцентного белка с улучшенным созреванием и пониженной чувствительностью к окружающей среде. Дж. Биол. Хим. 2002. https://doi.org/10.1074/jbc.M20

        00.

        Артикул пабмед Google ученый

      18. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К., Мияваки А. Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических приложений. Нац биотехнолог. 2002. https://doi.org/10.1038/nbt0102-87.

        Артикул пабмед Google ученый

      19. Риццо М.А., Спрингер Г., Сегава К., Зипфель В.Р., Поршень Д.В. Оптимизация пар и условий обнаружения для измерения FRET между голубыми и желтыми флуоресцентными белками. Микроск Микроанал. 2006. https://doi.org/10.1017/s1431

        6060235.

        Артикул пабмед Google ученый

      20. Хёфиг Х., Оттен Дж., Штеффен В., Поль М., Бурсма А.Дж., Фиттер Дж. Генетически закодированные биосенсоры на основе переноса энергии резонанса Фёрстера, изученные на уровне одной молекулы. Датчики СКУД. 2018 г. https://doi.org/10.1021/acssensors.8b00143.

        Артикул пабмед Google ученый

      21. Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C, et al. HaloTag: новая технология мечения белков для визуализации клеток и анализа белков. ACS Chem Biol. 2008 г. https://doi.org/10.1021/cb800025k.

        Артикул пабмед Google ученый

      22. Döbber J, Pohl M. HaloTag™: оценка ковалентной одностадийной иммобилизации для биокатализа. Дж Биотехнолог. 2017. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.12.004.

        Артикул пабмед Google ученый

      23. Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез путем удлинения перекрывания, управляемого ПЦР. Нат Проток. 2007. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.132.

        Артикул пабмед Google ученый

      24. Peroza EA, Boumezbeur A-H, Zamboni N. Быстрая рандомизированная разработка генетически кодируемых FRET-сенсоров для малых молекул. Аналитик. 2015 г. https://doi.org/10.1039/C5AN00707K.

        Артикул пабмед Google ученый

      25. «>

        Гибсон Д.Г., Янг Л., Чуанг Р.Ю., Вентер Дж.К., Хатчисон К.А., Смит Х.О. Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен тысяч оснований. Нат Методы. 2009. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318.

        Артикул пабмед Google ученый

      26. Ханахан Д. Исследования по трансформации Escherichia coli с плазмидами. Дж Мол Биол. 1983. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(83)80284-8.

        Артикул пабмед Google ученый

      27. Студиер Ф.В. Производство белка путем аутоиндукции при встряхивании культур с высокой плотностью. Protein Expr Purif. 2005. https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016.

        Артикул пабмед Google ученый

      28. Лакович младший. Принципы флуоресцентной спектроскопии. 16-е изд. Нью-Йорк: Kluwer Academic/Plenum; 1983. с. 954.

        Книга Google ученый

      29. Леммли Великобритания. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4. Природа. 1970. https://doi.org/10.1038/227680a0.

        Артикул пабмед Google ученый

      30. Keilhauer C, Eggeling L, Sahm H. Синтез изолейцина в Corynebacterium glutamicum : молекулярный анализ оперона ilvB-ilvN-ilvC. J Бактериол. 1993. https://doi.org/10.1128/jb.175.17.5595-5603.1993.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      31. Unthan S, Grünberger A, van Ooyen J, Gätgens J, Heinrich J, Paczia N, et al. Скорость роста выше 0,6: что заставляет Corynebacterium glutamicum достигать более высоких скоростей роста в определенной среде. Биотехнология Биоинж. 2014. https://doi.org/10.1002/bit. 25103.

        Артикул пабмед Google ученый

      32. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Молекулярное клонирование: лабораторное пособие. Спринг-Харбор: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор; 1989.

        Google ученый

      33. Никель Д.Б., Круз-Бурназу М.Н., Вильмс Т., Нойбауэр П., Неппер А. Генерация, анализ и оптимизация данных о биопроцессах в режиме онлайн для параллельной периодической ферментации с подпиткой в ​​миллилитровом масштабе. англ Life Sci. 2017. https://doi.org/10.1002/elsc.201600035.

        Артикул Google ученый

      34. Неппер А., Хайзер М., Глауш Ф., Нойбауэр П. Роботизированная платформа для параллельного культивирования и мониторинга параметров микробного роста в микролуночных планшетах. J Lab Автомат. 2014. https://doi.org/10.1177/2211068214547231.

        Артикул пабмед Google ученый

      35. Томола Н., Ахтинен Дж., Питканен Дж.П., Парвиайнен В., Йоэнвяяра С., Хаутамяки М. и др. Измерения внеклеточных метаболитов в аэробных периодических дрожжах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в реальном времени ( Saccharomyces cerevisiae ) культура. Биотехнолог Биопроцесс Инж. 2011. https://doi.org/10.1007/s12257-010-0147-3.

        Артикул Google ученый

      36. Döbber J, Pohl M, Ley SVV, Musio B. Быстрая, селективная и стабильная иммобилизация HaloTag- Lb ADH непосредственно из неочищенного клеточного экстракта для непрерывного биокаталитического производства хиральных спиртов и эпоксидов. Реагировать на химическую инженерию. 2018 г. https://doi.org/10.1039/C7RE00173H.

        Артикул Google ученый

      37. «>

        Дёббер Дж., Герлах Т., Офферманн Х., Ротер Д., Поль М. Закрытие пробела в эффективной иммобилизации биокатализаторов в непрерывных процессах: ферменты слияния HaloTag™ для непрерывного ферментативного каскада к вицинальному хиральному диолу. Зеленый хим. 2018 г. https://doi.org/10.1039/C7GC03225K.

        Артикул Google ученый

      38. Faccio G, Bannwarth MB, Schulenburg C, Steffen V, Jankowska D, Pohl M, et al. Инкапсуляция биосенсоров глюкозы и мальтозы на основе FRET для разработки функционализированных наночастиц кремнезема. Аналитик. 2016 г. https://doi.org/10.1039/C5AN02573G.

        Артикул пабмед Google ученый

      39. Тафвессон П., Лима-Рамос Дж., Нордблад М., Вудли Дж.М. Руководство и анализ затрат на производство катализаторов в биокаталитических процессах. Организационный процесс Res Dev. 2011. https://doi.org/10.1021/op1002165.

        Артикул Google ученый

      40. Биндер С., Шендзилорц Г., Стеблер Н., Крумбах К., Хоффманн К., Ботт М. и др. Высокопроизводительный подход для идентификации геномных вариантов продуцентов бактериальных метаболитов на уровне одной клетки. Геном биол. 2012 г. https://doi.org/10.1186/gb-2012-13-5-r40.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      41. Вемури Г.Н., Альтман Э., Сангурдекар Д.П., Ходурский А.Б., Эййтеман М.А. Метаболизм переполнения в Escherichia coli во время стационарного роста: регуляция транскрипции и влияние окислительно-восстановительного отношения. Appl Environ Microbiol. 2006. https://doi.org/10.1128/AEM.72.5.3653-3661.2006.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      42. Дуайер Массачусетс, Хеллинга Х. В. Периплазматические связывающие белки: универсальное суперсемейство для белковой инженерии. Curr Opin Struct Biol. 2004. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2004.07.004.

        Артикул пабмед Google ученый

      43. Се Х.В., Пфайффер З.А., Амисс Т.Дж., Шерман Д.Б., Питнер Д.Б. Прямое обнаружение глюкозы с помощью поверхностного плазмонного резонанса с бактериальным белком, связывающим глюкозу/галактозу. Биосенс ​​Биоэлектрон. 2004 г. https://doi.org/10.1016/S0956-5663(03)00271-9.

        Артикул пабмед Google ученый

      44. Tian Y, Cuneo MJ, Changela A, Höcker B, Beese LS, Hellinga HW. Основанный на структуре дизайн надежных биосенсоров глюкозы с использованием периплазматического белка, связывающего глюкозу Thermotoga maritima . Белковая наука. 2007 г. https://doi.org/10.1110/ps.072969407.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      45. «>

        Джеффри Си Джей. Разработка белков, связывающих периплазматический лиганд, в качестве наносенсоров глюкозы. Nano Rev. 2011. https://doi.org/10.3402/nano.v2i0.5743.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      46. Liu Y, Liu Y, Wang M. Дизайн, оптимизация и применение низкомолекулярных биосенсоров в метаболической инженерии. Фронт микробиол. 2017. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02012.

        Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

      47. Родригес Э.А., Кэмпбелл Р.Э., Лин Дж.И., Лин М.З., Мияваки А., Палмер А.Е. и др. Растущий и светящийся набор инструментов флуоресцентных и фотоактивных белков. Тенденции биохимических наук. 2017. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2016.09.010.

        Артикул пабмед Google ученый

      Скачать ссылки

      Благодарности

      Мы благодарим Эрика фон Лиреса за его поддержку в оценке данных.

      Финансирование

      Этот проект частично финансировался Федеральным министерством образования и исследований Германии (BMBF) в рамках проектов Optosys, FKZ 031A167B (J.O.) и Molecular Interaction Engineering, FKZ 031A095 (J.D.). Кроме того, эта работа была частично профинансирована Научным центром биоэкономики (BioSC, грант № 325‐40000213) в рамках проекта Focus FUND «HyImPAct – Гибридные процессы для важных прекурсоров и активных фармацевтических ингредиентов». (Н.Т.). Дальнейшее финансирование было получено от Программы создания пространств «Инновационные лаборатории Гельмгольца» Немецкой ассоциации Гельмгольца для поддержки «Лаборатории микробных биопроцессов» (RJ). Спонсоры-основатели не участвовали в разработке исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных; в написании рукописи и в решении опубликовать результаты.

      Author information

      Authors and Affiliations

      1. IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich GmbH, 52425, Jülich, Germany

        Julia Otten, Niklas Tenhaef, Roman P. Jansen, Johannes Döbber, Lisa Jungbluth, Stephan Noack, Марко Олдигес, Вольфганг Вихерт и Мартина Поль

      Авторы

      1. Юлия Оттен

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

      2. Niklas Tenhaef

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      3. Роман П. Янсен

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      4. Johannes Döbber

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      5. Lisa Jungbluth

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      6. Stephan Noack

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      7. Marco Oldiges

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      8. Вольфганг Вихерт

        Посмотреть публикации автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      9. Martina Pohl

        Просмотр публикаций автора

        Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

      Contributions

      JO, MP, SN и MO планировали исследование. JO сконструировал и охарактеризовал датчики на основе FRET. NT и JO проводили онлайн-эксперименты, RPJ и JO — онлайн-эксперименты. JO и MP написали рукопись с согласия всех авторов. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

      Автор, ответственный за переписку

      Мартина Поль.

      Декларация этики

      Утверждение этики и согласие на участие

      Неприменимо.

      Согласие на публикацию

      Не применимо.

      Конкурирующие интересы

      Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

      Дополнительная информация

      Примечание издателя

      Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

      Дополнительная информация

      Дополнительный файл 1.

      Дополнительная информация.

      Права и разрешения

      Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях международной лицензии Creative Commons Attribution 4. 0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе, при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное.

      Перепечатки и разрешения

      Об этой статье

      Феликс Карр | Лада (2019) | Доступно для продажи

      Средний

      Состояние

      Подпись

      Сертификат подлинности

      Ценовой диапазон малых гравюр Пабло Пикассо

      Просмотрите работы в этой категории

      Пожалуй, самым влиятельным художником 20-го века был Пабло Пикассо. наиболее известен новаторским кубизмом и разрушением двумерной плоскости изображения для передачи трехмерного пространства. Вдохновленный африканским и иберийским искусством, он также способствовал возникновению сюрреализма и экспрессионизма. Значительное творчество Пикассо выросло до более чем 20 000 картин, гравюр, рисунков, скульптур, керамики, театральных декораций и эскизов костюмов. Он написал свою самую известную работу «Герника» (1937) в ответ на гражданскую войну в Испании; тотемическое полотно гризайль остается определяющим произведением антивоенного искусства. На аукционе несколько картин Пикассо были проданы более чем за 100 миллионов долларов. Неутомимый художник был героем выставок в самых престижных учреждениях мира, от Музея современного искусства и Центра Помпиду до Stedelijk Museum и Tate Modern.

      FC

      Феликс Карр

      Британия, р. 1993

      Холст, масло, уголь

      59 1/10 × 47 1/5 дюйма

      150 × 120 см

      Художественное произведение

      Это .

      Сертификат

      Эта работа включает файл .

      2500–5000 фунтов стерлингов

      На кассе могут взиматься налоги. Учить больше.

      Доставка из Лондона, Великобритания

      Бесплатная доставка по всему миру

      Заблокировано

      Безопасная оплата

      Безопасные транзакции с помощью кредитной карты через Stripe.
      Узнать больше.

      Публичная галерея

      Лондон

      Получать уведомления, когда появится похожая работа

      Средний

      Состояние

      Подпись

      Сертификат подлинности

      Ценовые диапазоны малых гравюр Пабло Пикассо

      Просмотрите работы в этой категории

      Пабло Пикассо, пожалуй, самый влиятельный художник 20 века новаторский кубизм и разрушение двумерной плоскости изображения, чтобы передать трехмерное пространство. Вдохновленный африканским и иберийским искусством, он также способствовал возникновению сюрреализма и экспрессионизма. Значительное творчество Пикассо выросло до более чем 20 000 картин, гравюр, рисунков, скульптур, керамики, театральных декораций и эскизов костюмов. Он написал свою самую известную работу «Герника» (1937) в ответ на гражданскую войну в Испании; тотемическое полотно гризайль остается определяющим произведением антивоенного искусства. На аукционе несколько картин Пикассо были проданы более чем за 100 миллионов долларов. Неутомимый художник был героем выставок в самых престижных учреждениях мира, от Музея современного искусства и Центра Помпиду до Stedelijk Museum и Tate Modern.

      Серия «Художник»

      • Портреты художников и скульпторов

        113 available

      • Portraits of Artists and Sculptors

        113 available

      • Portraits of Artists and Sculptors

        113 available

      • Portraits of Artists and Sculptors

        113 available

      • Portraits of Artists and Скульпторы

        113 в наличии

      • Портреты художников и скульпторов

        113 в наличии

      • Портреты художников и скульпторов

        113 Доступно

      • Портреты художников и скульпторов

        113 Доступны

      • Портреты художников и скульпторов

        113

      • . Пабло Пикассо

        • Пабло Пикассо

          Пейзаж (Пейзаж), 1953

          Пейзаж (Пейзаж), 1953

        • Pablo Picasso

          Paysage (Landscape), 1953

          Paysage (Landscape), 1953

        • Pablo Picasso

          Paysage (Landscape), 1953

          Paysage (Landscape), 1953

        • Pablo Picasso

          Paysage (Пейзаж), 1953

          Пейзаж (Пейзаж), 1953

        Похожие художники

        Жорж Брак

        Французский 1900-2000

        Жорж Брак

      • 7

        Французский

        920 Жорж Брак

        Французский 1900-2000

        Жорж Брак

        Французский 1900-2000

        Музыканты из Остина получили 250 000 долларов на Black Fret Ball 2019

        Dr. кровь Остина. Любой, кто говорит вам другое, не провел субботний вечер на Ред-Ривер и не обнаружил случайного артиста во время SXSW. В любую ночь в Большом Остине можно выбрать из 100 шоу. Музыка — это часть того, кто мы есть.

        Но вены начинают сворачиваться. Рост стоимости жизни, более высокая арендная плата за помещения и десятки вариантов развлечений вынуждают артистов мирового уровня стагнировать.

        Введите Black Fret , некоммерческая организация, занимающаяся оказанием финансовой и практической поддержки музыкантам Остина. 7 декабря 2019 года во время ежегодного гала-концерта Black Fret Ball группа вручила 250 000 долларов 19 местным артистам. Это был вечер сердца, сообщества и благотворительности.

        Что такое черный лад?

        Соучредитель Black Fret Мэтт Отт с Ley Line на красной дорожке Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер) 3 посвящена поддержанию процветания музыки Остина за счет денежных грантов, справедливо оплачиваемых концертов и карьерного наставничества.

        Участники вносят ежегодный взнос, а взамен получают доступ к десяткам камерных шоу с участием лучших местных талантов Остина. Средства направляются в благотворительный фонд, который распределяется между художниками на основе голосов участников. На сегодняшний день Black Fret выделила более 1,5 миллиона долларов в виде грантов и прямых выплат местным исполнителям.

        Но получатели не получают мешок с деньгами со знаком доллара. Средства распределяются между победителями грантов через вехи карьерного роста. Нужен туристический фургон? Black Fret режет чек. Студийное время для новой записи? Black Fret оплачивает счет, все из обозначенных долларов, которые художник получил.

        Организация также предлагает программу наставничества. Известные профессионалы индустрии обучают артистов всему: от записи до промоушена и подготовки к гастролям. И все деньги возвращаются в музыкальную экосистему Остина, создавая устойчивую среду для процветания сцены.

        Все в духе благотворительности

        Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

        Год музыкальных выступлений и голосования участников завершился Black Fret Ball. Отчасти концерт, отчасти вечеринка и отчасти розыгрыш подарков Опры Уинфри, Театр Муди превратился в эпицентр щедрости и поддержки Остина. Каждый артист, назначенный участником, получил крупный (20 000 долларов) или небольшой (7 000 долларов) грант.

        Обычно небольшие гранты составляют 5000 долларов. Но в этом году Black Pumas пожертвовали свой основной грант обратно Black Fret, что позволило разделить средства между обладателями второстепенных наград. В результате сумма второстепенного гранта увеличилась до 7000 долларов. Это было удивительное проявление щедрости и заботы о музыкальном сообществе Остина.

        И победителями стали…

        Основные получатели грантов: 20 000 долларов США Получил крупный грант на Black Fret Ball 2019 (кредит: Билл Такер)

        1. Beat Root Revival
        2. Sydney Wright
        3. Superfónicos
        4. Dave Scher
        5. Ley Line
        6. Cari Hutson & Good Company
        7. The Watters
        8. The Cari Hutson & Good
        11. The Cari Hutson & Good Company
        14. the Cari Hutson & Good Company
        15. 9000
        16. The Cari Hutson & Good Company
        17. Техасский КГБ
        18. Western Youth

        Получатели второстепенных грантов: 7000 долларов США

        Think No Think получил грант в размере 7000 долларов США в 2019 годуBlack Fret Ball (Credit: Bill Tucker)
        1. Tje Austin
        2. Go Fever
        3. Altamesa
        4. Cilantro Boombox
        5. Erika Wennerstrom
        6. A. Sinclair
        7. Good Field
        8. Jonathan Terrell
        9. Think No Think
        10. Dr. Joe

        The Show, the Party, the Celebration

        Beat Root Revival на Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

        Концерт эпических масштабов был разбросан среди щедрости и хорошего настроения. Впервые 17 из 20 номинантов выступили в течение более чем четырехчасового мероприятия. Вечер начался с потрясающего выступления двух песен гитариста и мультиинструменталиста Beat Root Revival. Драйвовый бой Андреа Маги соответствовал яростной игре на гитаре Бена Джонса, отправив Moody Theater в безумие танцев на стульях.

        Другие основные моменты включали запоминающееся выступление Эрики Веннерстрем и театральное оживление (хотя и трагически короткое из-за нехватки времени), поставленное фаворитом Остинот, Superfónicos. Cilantro Boombox умолял толпу отказаться от телефонов и жить дальше, а позже присоединился к Ley Line в трогательной дани Дэниелу Джонстону. Их исполнение «Настоящая любовь найдет путь» было волшебным моментом. Сидни Райт во время выступления на Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

        Местные панк-рокеры Think No Think превратили гигантскую сцену Moody в трэш-сейшн CBGB, а Джонатан Террелл привнес кантри-рок в и без того зажигательный вечер. И я был бы упущен, если бы не упомянул мощное владение сценой, подобное Адель, Кэри Хатсон.

        Вечер завершился зажигательным исполнением двух песен в исполнении Dr. Joe, за которым последовало групповое исполнение «Lean on Me». Руки за плечи, несколько голосов в один микрофон, подпевание наполнило зал Moody Theatre и заставило все еще качающихся зрителей встать на ноги. Момент закрытия Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

        Это был мой третий Black Fret Ball, и каждый раз я вспоминаю об особой связи, которую поддерживает это сообщество. В мире, где музыканты постоянно соревнуются за лайки, прослушивания, посетителей и стримы, приятно осознавать, что такая богатая сцена, как у Остина, все еще может быть семьей. А с такими выдающимися организациями, как Black Fret, создающими устойчивую среду для процветания музыки, будущее выглядит светлым.

        Остинот является одним из основателей Black Fret. Чтобы получить дополнительную информацию и стать участником, посетите сайт blackfret.org.

        @BillTuckerTSP хочет знать:

        Кто ваш любимый исполнитель Black Fret?

        Молекулярный маяк CRISPR/dual-FRET для чувствительной визуализации живых клеток неповторяющихся геномных локусов | Исследование нуклеиновых кислот

        Журнальная статья

        Шици Мао,

        Шици Мао

        Ищите другие работы этого автора на:

        Оксфордский академический

        пабмед

        Google ученый

        Ячен Ин,

        Ячен Ин

        Ищите другие работы этого автора на:

        Оксфордский академический

        пабмед

        Google ученый

        Сяотянь Ву,

        Сяотянь Ву

        Ищите другие работы этого автора на:

        Оксфордский академический

        пабмед

        Google ученый

        Кристофер Дж. Крюгер,

        Кристофер Дж. Крюгер

        Ищите другие работы этого автора на:

        Оксфордский академический

        пабмед

        Google ученый

        Энтони К. Чен

        Энтони К Чен

        Ищите другие работы этого автора на:

        Оксфордский академический

        пабмед

        Google ученый

        Nucleic Acids Research , том 47, выпуск 20, 18 ноября 2019 г., страница e131, https://doi.org/10.1093/nar/gkz752

        Опубликовано:

        31 августа 2019 г.

        История статьи

        Получен:

        09 апреля 2019 г.

        Ревизия Получен:

        15 августа 2019 г.

        Принято:

        21 августа 2019

        Опубликовано:

        31 августа 2019

        9000
      • 557

        31 августа 2019

        9007 9000
      • 557 PDF
      • Разделенный вид
        • Содержание статьи
        • Рисунки и таблицы
        • видео
        • Аудио
        • Дополнительные данные

      • Цитировать

        Cite

        Shiqi Mao, Yachen Ying, Xiaotian Wu, Christopher J Krueger, Antony K Chen, молекулярный маяк CRISPR/dual-FRET для чувствительной визуализации неповторяющихся геномных локусов живыми клетками, Nucleic Acids Research , том 47, выпуск 20, 18 ноября 2019 г. , страница e131, https://doi.org/10.1093/nar/gkz752

        Выберите формат Выберите format.ris (Mendeley, Papers, Zotero).enw (EndNote).bibtex (BibTex).txt (Medlars, RefWorks)

        Закрыть

      • Разрешения

        • Электронная почта
        • Твиттер
        • Фейсбук
        • Подробнее

      Фильтр поиска панели навигации Исследование нуклеиновых кислотЭтот выпускКлеточная биологияХроматин и эпигенетикаЦелевая модификация геновNAR JournalsScience and MathematicsBooksJournalsOxford Academic Термин поиска мобильного микросайта

      Закрыть

      Фильтр поиска панели навигации Исследование нуклеиновых кислотЭтот выпускКлеточная биологияХроматин и эпигенетикаЦелевая модификация геновNAR JournalsScience and MathematicsBooksJournalsOxford Academic Термин поиска на микросайте

      Advanced Search

      Abstract

      Системы геномной визуализации, основанные на регулярно расположенных кластерах коротких палиндромных повторов (CRISPR), в основном полагаются на флуоресцентные белки-репортеры, которым не хватает оптических свойств, необходимых для чувствительной динамической визуализации. Здесь мы модифицировали CRISPR single-guide RNA (sgRNA), чтобы нести два разных молекулярных маяка (MB), которые могут подвергаться флуоресцентному резонансному переносу энергии (FRET), и продемонстрировали, что полученная система, CRISPR/dual-FRET MB, обеспечивает динамическую визуализацию неповторяющиеся геномные локусы только с тремя уникальными sgRNA.

      ВВЕДЕНИЕ

      Дезактивированный нуклеазой мутант белка 9 (dCas9), ассоциированного с кластерными регулярно расположенными короткими палиндромными повторами (CRISPR), сохраняет способность связываться со специфическим геномным локусом-мишенью посредством ассоциации с родственной Cas9 одинарной направляющей РНК (sgRNA) , тем самым стимулируя развитие основанных на CRISPR подходов к неинвазивной визуализации генома (1–10). Однако в большинстве подходов использовались dCas9 или sgRNA, модифицированные для переноса флуоресцентных белков (FP), которым не хватает яркости и фотостабильности, необходимых для непрерывной визуализации. Органические красители (флуорофоры) по сравнению с ФП, как правило, ярче и фотостабильнее. Кроме того, флуоресценция многих флуорофоров может быть значительно снижена, если они расположены в непосредственной близости от совместимого гасителя. Соответственно, на основе пар флуорофор-гаситель были разработаны различные флуорогенные зонды, позволяющие обнаруживать специфические биомолекулы в живых клетках без необходимости смывать несвязанные зонды. Одним из широко используемых флуорогенных зондов является молекулярный маяк (MB) (11), класс олигонуклеотидных зондов, образующих стебель-петлю, содержащих флуорофор и гаситель на двух концах, которые широко используются для визуализации РНК живых клеток (12–12). 14). Перед активацией MB демонстрируют низкий сигнал флуоресценции, поскольку комплементарные последовательности коротких плеч на двух концах самоотжигаются с образованием стабильного дуплекса стержня, который удерживает флуорофор и гаситель в непосредственной близости. Гибридизация РНК-мишени с петлевым доменом разрушает стволовой дуплекс, что приводит к отделению гасителя от флуорофора для восстановления флуоресценции MB.

      Признавая полезность sgRNA для геномного мечения и полезные флуорогенные свойства MB при гибридизации РНК, наша лаборатория недавно объединила системы CRISPR и MB для создания платформы геномной визуализации под названием CRISPR/MB (9), которая состоит из dCas9, MB и sgRNA, сконструированная так, чтобы содержать уникальную целевую последовательность MB, не обнаруженную в геноме человека (MTS). Чтобы осветить определенный геномный локус, dCas9 и модифицированную sgRNA сначала совместно экспрессируют для нацеливания на локус в клетках, после чего следует доставка MB, которые после гибридизации с MTS могут освещать целевой локус. Путем визуализации повторяющихся элементов внутри теломер мы продемонстрировали, что CRISPR/MB более эффективен и чувствителен, чем традиционные подходы, использующие белки, связывающие повторы теломер, слитые с FP. В этом исследовании мы стремились дополнительно усовершенствовать систему CRISPR / MB, модифицировав sgRNA, чтобы она содержала две разные последовательности-мишени MB (sgRNA_dual-MTS) для двух разных MB, флуорофоры которых образуют пару переноса энергии резонанса флуоресценции (FRET) (рис. 1). , стратегия, называемая двойной FRET MB (15,16). Поскольку FRET возникает только тогда, когда два MB гибридизуются с одной и той же РНК, ожидается, что MB с двойным FRET избегают фоновых сигналов, возникающих в результате несовершенного гашения и неспецифического связывания с белком одиночных MB. Были проведены специальные эксперименты для оценки возможностей предлагаемой нами системы, названной CRISPR/dual-FRET MB, для визуализации неповторяющихся областей в геномных локусах живых клеток с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии.

      Рисунок 1.

      Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

      Схема CRISPR/двойного FRET MB для маркировки конкретного локуса. Чтобы осветить конкретный геномный локус, dCas9 и sgRNA_dual-MTS сначала совместно экспрессировали для нацеливания на локус в клетках. За этим следует доставка как донорных, так и акцепторных MB (MB с двойным FRET), которые при гибридизации с одним и тем же двойным MTS могут привести к FRET для освещения локуса-мишени.

      МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

      Клонирование экспрессионных конструкций dCas9

      Для создания BFP/dCas9-C1, который кодирует BFP (контроль трансфекции) и дезактивированный нуклеазой Streptococcus pyogenes Cas9 (dCas9) под контролем отдельных промоторов, sgRNA, нацеленная на теломеры (sgTelo), была удалена из sgTelo/ BFP/dCas9-C1 описан ранее (9) с использованием AseI с последующим самолигированием полученного вектора. Для создания pCMV-dCas9-EGFP-C1, который кодирует dCas9, слитый с EGFP (dCas9-EGFP), кодирующую область dCas9-EGFP сначала амплифицировали с помощью ПЦР из pSLQ1658-dCas9.-EGFP (плазмида Addgene № 51023) (4) с использованием прямого праймера 5′-GTACCGGTCGCCACCATGGTGCCCAAAAAGAAGAGGAAAGTGGACAAGA-3′ и обратного праймера 5′-GTAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3′. Затем продукт ПЦР встраивали в вектор pmTagBFP2-C1 (подарок от Prabuddha Sengupta, исследовательский центр Janelia, США), расщепленный AgeI и EcoRI для вырезания mTagBFP2.

      Клонирование экспрессионных конструкций sgRNA

      Для мечения неповторяющихся областей

      Плазмида, содержащая кассету U6-sgRNA_dual-MTS, была изготовлена ​​на заказ Пекинским институтом геномики (Пекин, Китай) и использовалась для создания основной плазмиды для каждой sgRNA таргетинг на неповторяющийся регион. В частности, спейсерная последовательность sgRNA_dual-MTS была заменена спейсерной последовательностью, предназначенной для гибридизации с уникальной областью в пределах MUC4, MUC1 или локус IGR, или бессмысленная последовательность спейсера (контроль), с помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза (см. дополнительную таблицу S1 для информации о каркасе sgRNA, дополнительную таблицу S2 для информации о спейсере/области-мишени и дополнительную таблицу S3 для вводной информации). После этого продукт ПЦР кассеты U6-sgRNA_dual-MTS из каждой основной плазмиды (прямой праймер: 5′-ACTGCTGTCGACAATGCGTCGAGATCCAATTAGTTAT-3′; обратный праймер: 5′-ACCTGCGGATCCCTCGAGTTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC-3′) вставляли в pGEM-11zf(+) вектор, расщепленный SalI и BamHI, для создания конструкции экспрессии sgRNA для каждой sgRNA. Из полученных конструкций был создан набор мультиплексированных конструкций экспрессии sgRNA, содержащих различное количество уникальных кассет U6-sgRNA_dual-MTS (см. Дополнительную таблицу S4), с использованием протокола, описанного ранее van den Bogaard и Tyagi (17). Для MUC4 , мультиплексированная экспрессионная конструкция sgRNA, кодирующая три уникальные sgRNA без двойной MTS (sgMUC4) с теми же спейсерами, что и 3 sgMUC4_dual-MTS из набора I (см. дополнительные таблицы S1, таблицы S2 и таблицы S4), также была создана с использованием тот же протокол, с исходными конструкциями, полученными с помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза для удаления двойного MTS и дополнительных последовательностей, фланкирующих двойной MTS, с использованием прямого праймера 5′-GAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT-3′ и обратного праймера 5′-AAGTTGATAACGGACTAGCCTT-3 ‘.

      Для маркировки повторяющихся областей

      Для создания конструкции pSLQ1661-sgMUC4-E3(F+E)/BFP, которая кодирует немодифицированную sgRNA (без двойной MTS) со спейсерной последовательностью, комплементарной повторяющейся последовательности, проксимальной к не- повторяющиеся области гена MUC4 ( MUC4 -NRR), как описано выше (sgRNA-rep (проксимальнее MUC4 -NRR), см. дополнительные таблицы S1 и таблицу S5), mTagBFP2 был амплифицирован методом ПЦР из pmTagBFP2-C1. вектор с использованием прямого праймера 5′-AGCGCTACCGGTCGCCACCATG-3′ и обратного праймера 5′-ACTGCAGAATTCTTAATTAAGCTTGTGCCCCAGTTTGC-3′, а затем вставлен в pSLQ1661-sgMUC4-E3(F+E) (плазмида Addgene # 51025) (4), расщепленный с помощью AgeI и EcoRI для исключить mCherry. Для создания конструкций, которые кодируют sgRNAs, нацеленные на другие повторяющиеся области (см. Дополнительную таблицу S5), кассета U6-sgMUC4-E3(F+E) pSLQ1661-sgMUC4-E3(F+E)/BFP была сначала амплифицирована методом ПЦР с использованием прямого праймера 5. ‘-ACTGCTGTCGACTTTGGTTAGTACCGGGCCCGCTCTA-3′ и обратный праймер 5′-CTAATGGATCCTAGTACTCGAGAAA-3’ с последующим субклонированием продукта ПЦР в вектор pGEM-11zf(+), расщепленный SalI и BamHI. Последовательность спейсера в векторе субклонирования была заменена спейсером каждой sgRNA с помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза (см. дополнительную таблицу S6 для получения информации о праймерах). Область, которая содержит кассету U6-sgRNA в полученной плазмиде, затем клонировали обратно в pSLQ1661-sgMUC4-E3(F+E)/BFP, расщепленную XbaI и BamHI, для вырезания кассеты U6-sgMUC4-E3(F+E). .

      Синтез MB

      Донор MB был помечен гасителем Iowa Black FQ на 5′-конце и флуорофором ATTO550 на 3′-конце и имел последовательность: 5′-mCmUmCmAmG*mC*mG*mU* мА*мА*мГ*мУ*мГ*мА*мУ*мГ*мУ*мС*мГ*мУ*мГ*мА*мЦмУмГмАмГ-3′. Акцепторный MB был помечен флуорофором ATTO647N на 5′-конце и гасителем Iowa Black RQ на 3′-конце и имел последовательность: 5′-mCmUmUmCmG*mU*mC*mC*mA*mC*mA* mA*mA*mC*mA*mC*mA*mA*mC*mU*mC*mC*mU*mGmAmAmG-3′ (подчеркнутые буквы обозначают ствол MB, m представляет собой 2′- O -модификация метиловой РНК; * представляет модификацию фосфоротиоатной связи). Последовательности МВ предназначены для предотвращения гибридизации с эндогенными РНК в клетках млекопитающих. Все MB были синтезированы компанией Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA).

      Культура клеток и трансфекция

      Клетки HeLa и U2OS (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Mediatech), с добавлением 10% (об./об.) FBS (PAN™ Biotech) и 1× GlutaMAX ™ (Thermo Fisher) при 37°C, 5% (об./об.) CO 2  и относительной влажности 90 %. Трансфекцию плазмиды проводили с помощью FuGENE ® 6 (Promega) в соответствии с протоколами производителя, когда клетки достигали 50–70% слияния в 6-луночном планшете. Для визуализации неповторяющихся областей с использованием CRISPR/dual-FRET MB клетки HeLa или U2OS трансфицировали 600 нг BFP/dCas9-C1 и 1400 нг либо одной, либо мультиплексной экспрессионной конструкции sgRNA (см. дополнительную таблицу S4). Для экспериментов по совместному мечению клетки трансфицировали 600 нг pCMV-dCas9.-EGFP-C1, 600 нг мультиплексированной конструкции экспрессии sgRNA и 600 нг pSLQ1661-sgRNA-rep. Для экспериментов по гибридизации флуоресценции in situ клетки HeLa, высеянные на 8-луночное покровное стекло Lab-Tek™, предварительно покрытое фибронектином, трансфицировали 60 нг BFP/dCas9-C1, 60 нг pSLQ1661-sgRNA-rep (дистально до ). MUC4 -NRR) и 60 нг pSLQ1661-sgRNA-rep (проксимальнее MUC4 -NRR). Все эксперименты проводились с клетками с количеством пассажей от 5 до 25.

      Доставка MB

      MB были доставлены в клетки путем нуклеофекции/микропорации в соответствии с методами, описанными ранее (18–20), с модификациями. Вкратце, клетки, выращенные до 70% слияния, обрабатывали трипсином, промывали 1× PBS и осаждали с последующим ресуспендированием в 11 мкл 1× PBS, содержащего равные количества донорных и акцепторных MB, для получения конечной концентрации клеток 5000 клеток на мкл и конечная концентрация МБ 2 мкМ для каждого МБ. После этого 10 мкл клеточной смеси (примерно 50 000 клеток) подвергали нуклеофекции с использованием Neon 9.0014 ® Система трансфекции с параметрами, установленными на 1005 В с шириной импульса 35 мс и двумя импульсами всего для клеток HeLa и 1230 В с шириной импульса 10 мс и четырьмя импульсами всего для клеток U2OS. После нуклеофекции и трех промывок в культуральной среде для удаления свободных МБ клетки высевали на 8-луночное покровное стекло Lab-Tek TM , предварительно покрытое фибронектином.

      Следует отметить, что другие методы клеточной доставки, такие как стрептолизин-О (15), также использовались для доставки MB, и поэтому ожидается, что они будут эффективны для доставки донорных и акцепторных MB, используемых в этом исследовании.

      Флуоресценция

      Гибридизация in situ

      Клетки HeLa, содержащие dCas9, sgRNA-rep (дистально по отношению к MUC4 -NRR) и sgRNA-rep (проксимально по отношению к MUC4 -NRR) (см. дополнительную таблицу S5) (см. дополнительную таблицу S5) эксперименты по гибридизации in situ (FISH), как описано ранее (3,9), с модификациями. Вкратце, клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в 1× PBS в течение 30 минут при комнатной температуре с последующими двумя промываниями 1× PBS. После этого клетки пермеабилизировали 0,5% (об./об.) NP-40 в 1× PBS в течение 10 мин, а затем один раз промывали 1× PBS. После 5-минутной инкубации клеток в 1× PBS клетки инкубировали в гибридизационном буфере (1% (об./об.) Tween 9).0014 ® 20, 10% (об./об.) декстрансульфата, 50% (об./об.) формамида, 500 нг/мл ДНК спермы лосося в буфере 2× солевой раствор-цитрат натрия (SSC), содержащий 100 нМ зондов FISH (5 ‘-CCGTCAATTTTACTTTATGTCT-ATTO488-3′) и 100 нМ FISH-зондов (5′-TAMRA-CCTCCTGTCACCGAC-3’), нацеленных на повторяющиеся области, дистальные к MUC4 -NRR и проксимальные к MUC4 -NRR, соответственно, во влажной среде. камере при 37°С в течение 24 часов. Клетки промывали промывочным буфером (2× SSC, 10% (об./об.) формамида), затем 2× SSC, 1× SSC и 0,2× SSC для удаления негибридизированных зондов, а затем инкубировали в 1× PBS перед визуализацией. Следует отметить, что взаимодействия между dCas9и sgRNA приводят к раскручиванию дуплекса ДНК, позволяя зондам FISH гибридизоваться с цепью, не связанной со спейсером sgRNA, без необходимости нагревания при высокой температуре.

      Флуоресцентная микроскопия

      Эксперименты по флуоресцентной микроскопии проводились на моторизованном инвертированном флуоресцентном микроскопе Olympus IX 83, оснащенном системой CellTIRF-4Line, объективом 100× UPlanSApo 1.4NA, камерой EMCCD с задней подсветкой (Andor), возбуждением по Саттеру и круги эмиссионных фильтров под управлением программного обеспечения CellSens Dimension. Изображения DAPI, EGFP/ATTO488 и TAMRA были получены с использованием набора фильтров Olympus MT20 для DAPI, EGFP и TAMRA, а изображения FRET и ATTO647N были получены с использованием наборов фильтров Chroma (ET545/25x, ET700/75m, T565lpxr) и (ET620/ 60x, ET700/75m, T660lpxr), соответственно, с возбуждающим светом, обеспечиваемым источником света X-Cite Series 120 с ртутной лампой (EXFO). Одновременные двухцветные изображения EGFP и FRET были получены с использованием IX3-U-m4TIR-Sbx и куба DV2 (ET525/50m, 585dcxr, ET655lp, Photometrics) с возбуждающим светом EGFP и FRET, полученным с помощью 488-нм лазерная линия (150 мВт) и лазерная линия 561 нм (150 мВт) соответственно. Стеки трехмерных (3D) изображений были получены с шагом 0,25 мкм в направлении z. Все изображения были проанализированы с использованием Fiji (21), программного обеспечения для деконволюции AutoQuant (MediaCybernetics) или специально написанных программ MATLAB (64-разрядная версия R2014b, Mathworks).

      Идентификация одиночных геномных локусов

      Идентификацию одиночных геномных локусов в клетках HeLa и U2OS проводили, как описано ранее (18,19), с небольшими модификациями. Вкратце, вычитание фона в виде катящегося шара (фон = 2) впервые было применено ко всем 3D-изображениям для улучшения качества объектов в виде частиц. За этим последовала идентификация частиц с использованием подключаемого модуля 3D Laplacian of Gaussian, доступного для Фиджи. После ручной установки порога для удаления пятен низкой интенсивности область интереса (ROI) была нарисована вокруг каждого ядра и применена к отфильтрованному стеку. Подключаемый модуль макроса Find Stack Maxima (Exclude Edge Maxima; Noise Tolerance = 0) затем использовался для определения всех локальных максимумов в каждом срезе z-стека. Чтобы определить, какие двумерные (2D) локальные максимумы являются трехмерными локальными максимумами, и количественно определить общее количество трехмерных локальных максимумов, была написана пользовательская программа MATLAB для сравнения интенсивности каждого локального максимума в каждом срезе с интенсивностью каждого пикселя в пределах куб вокселей 5 × 5 × 5 с центром вокруг локального максимума. Каждый 3D-максимум считался отдельным локусом и вычислялось общее количество локусов на ядро.

      Трехмерный анализ колокализации

      После определения трехмерных координат геномных локусов на изображениях dCas9-EGFP и dual-FRET MB с использованием описанных выше методов была использована специальная программа MATLAB для определения уровня колокализации в трехмерном изображении, как описано ранее (18 19) с небольшими изменениями. Вкратце, локальный 3D-максимум MB считался событием колокализации MB, если локальный 3D-максимум EGFP был обнаружен в кубе вокселов 7 × 7 × 7 с центром вокруг максимума MB. Процент колокализации рассчитывали путем деления количества событий колокализации МБ на общее количество локальных максимумов МБ.

      Анализ отношения сигнал-шум

      2D-изображения были получены как для двойных FRET MB, так и для одиночных MB с выдержкой в ​​одну секунду и подвергнуты анализу отношения сигнал/шум (SNR), как описано ранее (22). , по следующей формуле:

      $$\begin{equation*}{\rm{SNR}} = \frac{{{{\rm{i}}_{{\rm{пятно\сигнал,\максимум}} }} — {{\rm{i}}_{{\rm{фон,\среднее}}}}}}{{{{\rm{i}}_{{\rm{фон,\\sigma}} }}}}\end{equation*}$$

      , где i точечный сигнал, максимум относится к максимальной интенсивности флуоресценции одного геномного локуса, i фон, среднее значение относится к среднему фоновому сигналу и i фон, σ относится к стандартному отклонению фонового сигнала.

      Анализ отслеживания отдельных частиц

      2D-изображения с интервальной съемкой были проанализированы для идентификации следов отдельных геномных локусов с использованием подключаемого модуля TrackMate от Fiji, как описано ранее (18,19). Вкратце, отдельные пики и их координаты определяли с помощью детектора Лапласа или Гаусса (LoG). После этого пики, принадлежащие одной и той же дорожке, определялись с помощью простого средства отслеживания проблем линейного назначения (LAP). Полученные треки затем использовались для анализа совместного движения и коэффициента диффузии, как описано ниже:

      Анализ сопутствующего движения . Для анализа совместного движения между пятном, меченным dCas9-EGFP, и пятном, меченным CRISPR/dual-FRET MB, использовались одновременные двухцветные изображения, полученные со скоростью 10 кадров в секунду (fps). В наборе двухцветных изображений пятна в канале EGFP и в канале FRET были объединены в пары на основе ближайшего пространственного расстояния. После назначения пар пятен были определены координаты x – y каждого пятна с параметрами LAP, установленными на максимальном расстоянии связи = 0,5 мкм; максимальное расстояние закрытия разрыва = 0; закрытие промежутка: максимальный зазор кадра = 0, после чего проводится кросс-корреляционный анализ пар точек в MATLAB на основе следующей формулы, как описано ранее (23): 9{1/2}}}}{\rm{\ }}\end{equation*}$$

      , где ρ — коэффициент взаимной корреляции, r EGFP и r FRET представляют собой векторы положения пятен, меченных dCas9-EGFP и CRISPR/dual-FRET MB, соответственно. ρ колеблется от -1 для полностью антикоррелированных движений до +1 для полностью коррелированных движений.

      Анализ коэффициента диффузии . Для анализа коэффициентов диффузии использовались изображения, полученные со скоростью 50 кадров в секунду, с параметрами LAP, установленными на максимальном расстоянии связи = 0,1 мкм; максимальное расстояние закрытия зазора = 0,4 мкм; закрытие промежутка макс. промежутка кадра = 4. Результирующие пики и их 9\alpha }\end{equation*}$$

      с использованием первых 25% от общего времени запаздывания с минимальным порогом подгонки R 2 > 0,8. Треки с α < 1,2 представляли собой диффузию, тогда как треки с α > 1,2 представляли собой направленный транспорт.

      Анализ данных

      Статистический анализ проводили с использованием либо двустороннего критерия Стьюдента t , либо однофакторного дисперсионного анализа с апостериорной проверкой парных сравнений с использованием критерия Шеффе.

      РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

      Оценка чувствительности CRISPR/dual-FRET MB для визуализации неповторяющихся областей генома

      Мы сконструировали sgRNA-экспрессирующие плазмиды, которые кодируют 1, 2, 3 или 6 уникальных sgRNA_dual-MTS для мечения неповторяющихся областей MUC4 (sgMUC4_dual-MTS) со спейсерными последовательностями, нацеленными на ДНК, выбранными из пула 73 MUC4 , нацеленных на sgRNA (4), ранее использовавшихся для визуализации CRISPR на основе FP (дополнительные таблицы S1 – S4). После совместной трансфекции модифицированных sgRNAs вместе с dCas9и BFP (в качестве контроля трансфекции) в клетках HeLa, доставку в ядро ​​меченных ATTO550 донорских MB FRET и меченных ATTO647N акцепторных MB FRET достигали посредством нуклеофекции. В качестве контроля клетки также трансфицировали sgRNA_dual-MTS, несущим нонсенс-спейсерную последовательность (sgControl_dual-MTS), и нуклеофицировали MB. Было высказано предположение, что если двойной MTS не препятствует связыванию dCas9 с локусом-мишенью под управлением sgRNA, гибридизация как донорных, так и акцепторных MB с двойным MTS, приводящая к FRET, должна освещать 9Локус 1304 MUC4 в виде яркого пятна при просмотре с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что через 24 ч после доставки MB яркие пятна в количестве от 1 до 6 копий можно было обнаружить в 41% и 39% клеток с 6 и 3 sgMUC4_dual-MTS соответственно (рис. 2). Среднее (± стандартная ошибка) количество пятен составляло 2,54 ± 0,13 и 2,45 ± 0,11 в клетках с шестью и тремя sgRNA соответственно, что согласуется с ранее опубликованными значениями для локуса MUC4 в клетках HeLa (4, 25). Напротив, в клетках, трансфицированных двумя или одной sgRNA, было обнаружено очень мало пятен, аналогично результатам, наблюдаемым с sgControl_dual-MTS. Поскольку яркие пятна присутствовали в клетках с sgMUC4_dual-MTS, но в очень малой степени в клетках с контрольной sgRNA, по-видимому, наблюдаемые пятна возникают из-за гибридизации MB с dCas9.Комплексы -sgRNA, связанные с локусом MUC4 , а не со свободными sgRNA или комплексами dCas9-sgRNA. В подтверждение этого аналогичные эксперименты, проведенные в клетках U2OS, также показали, что CRISPR/dual-FRET MB может освещать неповторяющиеся области MUC4 с тремя уникальными sgMUC4_dual-MTS, но не с sgControl_dual-MTS (дополнительный рисунок S1A и B). Кроме того, сигналы двойного FRET MB были очень близки к клеточному фону в клетках с тремя немодифицированными sgRNA (без двойного MTS), нацеленными на одни и те же MUC4 неповторяющихся областей (sgMUC4) (дополнительная фигура S2), подтверждая, что пятна, наблюдаемые в клетках с тремя уникальными sgMUC4_dual-MTS, возникли в результате специфической гибридизации MB с двойной MTS. Доказательства того, что CRISPR/dual-FRET MB действительно может маркировать неповторяющиеся области MUC4 тремя уникальными sgRNA, были получены в результате экспериментов по совместному маркированию с использованием dCas9, слитого с EGFP (dCas9-EGFP), и немодифицированной sgRNA (без двойного MTS), нацеленной на повторяющиеся области достаточного размера, необходимые для обнаружения (4), на одной и той же хромосоме (рис. 3А и В). В частности, локализация и движение сигналов CRISPR/dual-FRET MB хорошо согласовывались с сигналами dCas9.-EGFP, когда немодифицированная sgRNA рекрутировала несколько dCas9-EGFP в повторяющиеся области в пределах локуса MUC4 , но не когда dCas9-EGFP была нацелена на более отдаленные повторяющиеся области (рис. 3C–E, дополнительные рисунки S1C–F, S3 и дополнительные фильмы S1–S4). Кроме того, CRISPR/dual-FRET MB может также освещать неповторяющиеся области гена MUC1 и область межгенной ДНК (IGR) при использовании трех уникальных MUC1 -нацеленных sgRNA_dual-MTS (sgMUC1_dual-MTS) или IGR-нацеленных sgRNA_dual-MTS (sgIGR_dual-MTS) соответственно (дополнительные рисунки S4, S5 и дополнительные фильмы S5-S8). Примечательно, что эффективность обнаружения сильно зависела от выбора sgRNA, поскольку второй набор sgRNA давал гораздо более низкую эффективность обнаружения, чем первичный набор (Set I) для каждого локуса (дополнительная фигура S6), предположительно потому, что не все области генома одинаково доступны для dCas9-комплексы sgRNA из-за различий в топологической сложности или наличия ДНК-связывающих белков. Таким образом, необходимо провести скрининг sgRNAs, которые могут обеспечить эффективность обнаружения намного выше фонового уровня (т.е. 2,3% клеток с неспецифическими пятнами при экспрессии sgControl_dual-MTS, см. рисунок 2B). Наконец, было достигнуто более низкое отношение сигнал-шум и было обнаружено меньше геномных локусов, когда одиночные MB использовались для изображения локусов MUC4 по сравнению с двойными FRET MB (дополнительная фигура S7), что позволяет предположить, что в контексте геномной визуализации , подход с двойным FRET MB более чувствителен, чем подход с одним MB, как видно из предыдущих исследований, когда два подхода сравнивались в контексте визуализации РНК (15,16). В совокупности эти результаты показывают, что CRISPR/dual-FRET MB при использовании в сочетании с широкопольной флуоресцентной микроскопией может освещать неповторяющиеся области генома всего лишь с тремя уникальными sgRNA.

      Рисунок 2.

      Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

      Визуализация неповторяющихся областей MUC4 с помощью CRISPR/двойного FRET MB с различным количеством уникальных MUC4 , нацеленных на sgRNA. Клетки HeLa, экспрессирующие dCas9 и 6, 3, 2 или 1 уникальный sgMUC4_dual-MTS или sgControl_dual-MTS, были нуклеофицированы MB с двойным FRET. Изображения флуоресцентной микроскопии были получены через 24 часа после нуклеофекции. ( A ) Репрезентативные проекционные изображения с максимальной интенсивностью сигналов Dual-FRET MB в фиксированных ячейках. Масштабная линейка, 10 мкм. ( B ) Распределение количества пятен по клеткам. На вставке показана эффективность обнаружения. n = 300 клеток из трех независимых экспериментов для каждого условия.

      Рисунок 3.

      Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

      CRISPR/dual-FRET MB может освещать неповторяющиеся области MUC4 с помощью 3 уникальных sgRNA. Клетки HeLa, экспрессирующие dCas9-EGFP, три уникальных sgMUC4_dual-MTS (набор I, см. дополнительную таблицу S4) и немодифицированную sgRNA, нацеленную на высокоповторяющиеся области генома (sgRNA-rep) на той же хромосоме (Chr3), были подвергнуты нуклеофекции с помощью двойного FRET. Мб. ( A ) Схема эксперимента по совместному мечению. ( B ) Схема, показывающая положение неповторяющихся областей (NRR) и повторяющихся областей (RR) проксимальнее или дистальнее NRR на Chr3, выбранном для мечения. ( C ) Репрезентативные проекционные изображения максимальной интенсивности сигналов Dual-FRET MB и dCas9-EGFP в фиксированных клетках. Вставка показывает совместную локализацию двух сигналов, когда dCas9-EGFP метит проксимальный RR через sgRNA-rep. Масштабная линейка, 10 мкм. ( D ) Процент сигналов двойного FRET MB, колокализирующихся с dCas9Сигналы -EGFP (% Colocalization dual-FRET MB), представляющие проксимальный или дистальный RR на уровне клеток (n = 35 клеток для проксимального RR и 30 клеток для дистального RR). ( E ) Коэффициент корреляции между сигналами двойного FRET MB и dCas9-EGFP (коэффициент совместного движения) в живых клетках. 15 траекторий каждого сигнала были проанализированы для проксимальной RR и 18 траекторий каждого сигнала были проанализированы для дистальной RR, обе из 12 клеток. Обратите внимание, что коэффициент совместного движения, равный 1, указывает на идеальное совместное движение. Все данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка. из трех независимых экспериментов. Звездочки обозначают P -значения (*** P < 0,001).

      Изучение динамики неповторяющихся геномных локусов с использованием CRISPR/dual-FRET MB

      Хроматин очень динамичен и подвержен ремоделированию (26). Таким образом, метод, способный фиксировать движение определенного геномного локуса с высоким пространственно-временным разрешением, должен способствовать углубленной характеристике архитектуры генома в режиме реального времени. Успешно продемонстрировав способность CRISPR/dual-FRET MB освещать неповторяющиеся локусы с помощью трех уникальных sgRNA, мы затем оценили возможности этой стратегии для визуализации динамики хроматина. Чтобы проверить это, мы осветили неповторяющиеся области MUC4, MUC1 и IGR в клетках HeLa с использованием CRISPR/dual-FRET MB с тремя sgMUC4_dual-MTS, sgMUC1_dual-MTS и sgIGR_dual-MTS (Набор I, см. Дополнительный рисунок S6) соответственно. Интересно, что анализ отслеживания отдельных частиц показал, что, хотя все обнаруженные локусы демонстрировали диффузионное поведение (α <1,2), три разных локуса демонстрировали уникальные диапазоны движения, а также коэффициенты диффузии (рис. 4 и дополнительные фильмы S9–S11), предположительно отражая их различия в активности транскрипции и локальной среде (27). Мы должны подчеркнуть, что три sgRNA, используемые для визуализации, предназначены для нацеливания на ~ 770 п.н. в MUC4 , ~300 п.н. в MUC1 и ~220 п.н. в IGR, были выбраны на основании доступности мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM), и специфичности спейсера. Наш CRISPR/двойной FRET MB также должен позволять визуализировать другие неповторяющиеся области аналогичного или меньшего размера, предлагая возможность для мониторинга архитектуры генома в живых клетках с высоким разрешением.

      Рисунок 4.

      Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

      Динамика одиночных локусов MUC4, MUC1 и IGR, выявленных с помощью CRISPR/dual-FRET MB с тремя уникальными sgRNA_dual-MTS. Клетки HeLa, экспрессирующие dCas9и три уникальных sgMUC4_dual-MTS, sgMUC1_dual-MTS или sgIGR_dual-MTS (набор I) были нуклеофицированы с помощью MB с двойным FRET. Изображения флуоресцентной микроскопии были получены через 24 часа после нуклеофекции. ( A ) Репрезентативные траектории отдельных локусов, полученные в течение временного окна 0,5 с. Пунктирные кружки указывают диапазон движения. ( B ) Графики рассеяния коэффициентов диффузии (D eff ) отдельных локусов. Суммарные траектории MUC4 (89 траекторий), MUC1 (80 траекторий) и IGR (88 траекторий) были проанализированы из 81, 68 и 75 клеток соответственно. Все данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка. из трех независимых экспериментов. Звездочки обозначают P -значения (** P < 0,01, *** P < 0,001).

      Заключение

      Таким образом, мы объединили CRISPR и MB с двойным FRET для разработки системы MB CRISPR/Dual-FRET, которую можно использовать для измерения динамики неповторяющихся областей отдельных геномных локусов в геноме человека с всего три уникальных sgRNAs. Следует отметить, что неповторяющиеся области генома ранее визуализировались с помощью методов визуализации CRISPR на основе FP с помощью дифракционно-ограниченной флуоресцентной микроскопии (4, 6–8), с одной чувствительной системой, в которой используются 4 уникальные sgRNAs, нацеленные на ~ 3800 п. н. в пределах MUC4 сообщает о наличии в среднем 2,2 пятна на клетку (6), каждая sgRNA была значительно модифицирована, чтобы содержать 16 аптамеров MS2 для мечения 32 копий белка оболочки MS2, слитого с FP (MCP-FP), что вызывает опасения относительно того, меченые локусы проявляют нормальную физиологическую активность. Кроме того, необходимость добавления нескольких копий аптамера в тандеме может усложнить клонирование, поскольку плазмиды, кодирующие множественные тандемные повторы, подвержены рекомбинации. Более того, комплексы dCas9-sgRNA, помеченные несколькими FP, могут быть очень восприимчивы к агрегации, что приводит к образованию высокоинтенсивных неспецифических точек, которые могут быть неверно истолкованы как геномные локусы (10). Учитывая, что общая масса одного комплекса визуализации CRISPR/двойного FRET MB (~242 кДа) составляет примерно 14% от общей массы одного комплекса визуализации системы на основе MS2, несущей 32 MCP-FP (~1,76 МДа) (Дополнительная таблица S7), и обе системы демонстрируют одинаковую эффективность обнаружения для MUC4 неповторяющихся областей, мы пришли к выводу, что CRISPR/dual-FRET MB представляет собой высокочувствительную платформу для визуализации неповторяющихся локусов генома в живых клетках, способную наиболее точно отражать нормальную динамику хроматина на сегодняшний день.

      Мы также должны подчеркнуть, что, хотя технология CRISPR/двойного FRET MB демонстрирует гораздо большую чувствительность для обнаружения геномных локусов, чем ее родительский подход, использующий одиночный MB, она может быть менее применима в исследованиях, где необходимо визуализировать несколько геномных локусов одновременно. поскольку новая технология влечет за собой два оптически различных MB для получения сигнала FRET. Мы предполагаем использование более продвинутых оптических методов, таких как изображения сверхвысокого разрешения (28) и многоспектральные изображения (29).), а включение более продвинутых пар флуорофора/гасителя может расширить универсальность CRISPR/двойного FRET MB, позволяя изучать как короткие, так и длинные организации генома, а также их физиологические роли в широком диапазоне пространственных и временных масштабов. .

      ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

      Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

      ФИНАНСИРОВАНИЕ

      Ключевая национальная программа исследований и разработок Китая [2016YFA0100702 и 2016YFA0501603]; Национальный фонд естественных наук Китая [31771583]. Финансирование платы за открытый доступ: Национальная ключевая программа исследований и разработок Китая [2016YFA0100702].

      Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

      Список литературы

      1.

      Knight

      S.

      ,

      TJIAN

      R.

      ,

      Doudna

      J.

      GENOMES

      Doudna

      J.

      60 GENOMES.

      .

      Анж. хим. Междунар. Эд. англ.

      2017

      ;

      57

      :

      4329

      –

      4337

      .

      2.

      Wu

      X.

      ,

      Mao

      S.

      ,

      Ying

      Y.

      ,

      Krueger

      C.J.

      ,

      Chen

      A.K.

      Прогресс и проблемы в области визуализации геномных локусов живых клеток с использованием платформ на основе CRISPR

      .

      Геномика Протеомика Биоинформатика

      .

      2019

      ;

      17

      :

      119

      –

      128

      .

      3.

      Chen

      B.

      ,

      Guan

      J.

      ,

      HUANG

      B.

      ИМЕРИЯ Специфическая GENOMIC DNA DNA в Life Life

      77770. B.

      .

      год. Преподобный Биофиз.

      2016

      ;

      45

      :

      1

      –

      23

      .

      4.

      Чен

      Б.Х.

      ,

      Гилберт

      Л.А.

      ,

      Чимини

      Б.А.

      ,

      Schnitzbauer

      J.

      ,

      Чжан

      W.

      ,

      Li

      G.W

      ,

      Парк

      Дж.

      ,

      Блэкберн

      Э.Х.

      ,

      Вайсман

      Дж.С.

      ,

      Ци

      Л. С.

      и др. .

      Динамическая визуализация геномных локусов в живых клетках человека с помощью оптимизированной системы CRISPR/Cas

      .

      Сотовый

      .

      2013

      ;

      155

      :

      1479

      –

      1491

      .

      5.

      MA

      H.

      ,

      Naseri

      A.

      ,

      REYES-Gutierrez

      P.

      ,

      • 066066066060606060606060606060606060606060606060606060606060606060606060606606тся

      P.

      0057

      S.A.

      ,

      Zhang

      S.

      ,

      Pederson

      T.

      Многоцветная маркировка CRISPR 9 локусов хромосом человека 5.00 90 90

      Проц. Натл. акад. науч. США

      2015

      ;

      112

      :

      3002

      –

      3007

      .

      6.

      Цинь

      П.В.

      ,

      Парлак

      М.

      ,

      Kuscu

      C.

      ,

      Bandaria

      J.

      ,

      Mir

      M.

      ,

      Szlachta

      K.

      ,

      Singh

      R.

      ,

      DARZACQ

      X.

      ,

      YILDIZ

      A.

      ,

      ADLI

      M.

      Live Imaging of Low-and non-repeptivity hROMOSMOS-CRIS9.09:20 .

      Нац. коммун.

      2017

      ;

      8

      :

      14725

      .

      7.

      Shao

      S.

      ,

      Chang

      L.

      ,

      Sun

      Y.

      ,

      Hou

      Y.

      ,

      Fan

      X

      ,

      Sun

      Y.

      Мультиплексная экспрессия sgRNA обеспечивает универсальную одиночную неповторяющуюся маркировку ДНК и регуляцию эндогенных генов

      .

      Синтезатор ACS. биол.

      2018

      ;

      7

      :

      176

      –

      186

      .

      8.

      Gu

      B.

      ,

      Swigut

      T.

      ,

      Spencley

      A.

      ,

      Bauer

      M.R.

      ,

      Chung

      M.

      ,

      Мейер

      Т.

      ,

      Wysocka

      J.

      Связанные с транскрипцией изменения ядерной подвижности цис-регуляторных элементов млекопитающих

      .

      Наука

      .

      2018

      ;

      359

      :

      1050

      –

      1055

      .

      9.

      WU

      X.

      ,

      MAO

      S.

      ,

      Yang

      Y.

      ,

      606077777777777777777777777777777777777777777777

      ,

      60677

      Y.

      ,

      60677

      Y.

      ,

      677

      Y.

      .0060 М.Н.

      ,

      Крюгер

      CJ

      ,

      Чен

      А.К.

      Гибридная система CRISPR/молекулярного маяка для геномной визуализации живых клеток

      .

      Рез. нуклеиновых кислот.

      2018

      ;

      46

      :

      е80

      .

      10.

      Хун

      Й.

      ,

      Лу

      Г.

      ,

      Дуань

      5 Дж.

      ,

      Liu

      W.

      ,

      Zhang

      Y.

      Сравнение и оптимизация систем мечения генома CRISPR/dCas9/гРНК для визуализации живых клеток

      7 90.

      Геном Биол.

      2018

      ;

      19

      :

      39

      .

      11.

      Тяги

      С.

      ,

      Крамер

      Ф.Р.

      Молекулярные маяки: зонды, флуоресцирующие при гибридизации

      .

      Нац. Биотехнолог.

      1996

      ;

      14

      :

      303

      –

      308

      .

      12.

      BAO

      G.

      ,

      RHEE

      Вт.

      год. Преподобный Биомед. англ.

      2009

      ;

      11

      :

      25

      –

      47

      .

      13.

      Ma

      Z.

      ,

      Wu

      X.

      ,

      Krueger

      C.J.

      ,

      Chen

      A.K.

      Разработка новых молекулярных маяков для изучения динамики и локализации внутриклеточной РНК

      .

      Геномика Протеомика Биоинформатика

      .

      2017

      ;

      15

      :

      279

      –

      286

      .

      14.

      Zheng

      J.

      ,

      Yang

      R.

      ,

      Shi

      M.

      ,

      Wu

      C.

      ,

      Fang

      X .

      ,

      Li

      Y.

      ,

      Li

      J.

      ,

      Tan

      W.

      Rationally designed molecular beacons for bioanalytical and biomedical applications

      .

      Хим. соц.

      2015

      ;

      44

      :

      3036

      –

      3055

      .

      15.

      Santangelo

      P. J.

      ,

      Nix

      B.

      ,

      Tsourkas

      A.

      ,

      Bao

      G.

      Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in живые клетки

      .

      Рез. нуклеиновых кислот.

      2004

      ;

      32

      :

      e57

      .

      16.

      Tsourkas

      A.

      ,

      Behlke

      M.A.

      ,

      Xu

      Y.

      ,

      Bao

      G.

      Spectroscopic features of dual fluorescence/luminescence resonance молекулярные маяки с передачей энергии

      .

      Анал. хим.

      2003

      ;

      75

      :

      3697

      –

      3703

      .

      17.

      ван ден Богард

      П.Т.

      ,

      Tyagi

      S.

      Использование молекулярных маяков для изучения распространения мРНП из генного локуса

      .

      Методы Мол. биол.

      2009

      ;

      464

      :

      91

      –

      103

      .

      18.

      Чен

      М.М.

      ,

      Ma

      Z.

      ,

      Wu

      X.T.

      ,

      Мао

      S. Q.

      ,

      Ян

      Ю.Т.

      ,

      Тан

      Дж.

      ,

      Крюгер

      Си Джей

      ,

      Чен

      А.К.

      Подход на основе молекулярных маяков для визуализации транскриптов РНК в живых клетках с минимальной инженерией мишени на уровне одной молекулы

      .

      Науч. Респ.

      2017

      ;

      7

      :

      1550

      .

      19.

      Чжао

      Д.

      ,

      Ян

      Ю.Т.

      ,

      Цюй

      Н.

      ,

      Чен

      М.М.

      ,

      Ma

      Z.

      ,

      Крюгер

      CJ

      ,

      Белке

    • M. A.0.7

      920 ,

      Чен

      А.К.

      Обнаружение отдельных молекул и отслеживание транскриптов РНК в живых клетках с использованием молекулярных маяков 2′-O-метилРНК, оптимизированных для фосфоротиоата

      .

      Биоматериалы

      .

      2016

      ;

      100

      :

      172

      –

      183

      .

      20.

      Чен

      А.К.

      ,

      Бельке

      М.А.

      ,

      Tsourkas

      A.

      Эффективная цитозольная доставка конъюгатов молекулярных маяков и проточный цитометрический анализ целевой РНК

      .

      Рез. нуклеиновых кислот.

      2008

      ;

      36

      :

      e69

      .

      21.

      Schindelin

      J.

      ,

      Arganda-Carreras

      I.

      ,

      FRIS0060 Kaynig

      V.

      ,

      Longair

      M.

      ,

      Pietzsch

      T.

      ,

      Preibisch

      S.

      ,

      Rueden

      C.

      ,

      Saalfeld

      S.

      ,

      Schmid

      B.

      и др. .

      Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений

      .

      Нац. Методы

      .

      2012

      ;

      9

      :

      676

      –

      682

      .

      22.

      Chen

      B.

      ,

      Zou

      W.

      ,

      Xu

      H.

      ,

      Liang

      Y.

      ,

      Huang

      B

      Эффективное мечение и визуализация кодирующих белок генов в живых клетках с использованием CRISPR-Tag

      .

      Нац. коммун.

      2018

      ;

      9

      :

      5065

      .

      23.

      Hunenberger

      P.H.

      ,

      Марк

      A.E.

      ,

      Vangunsteren

      W.F.

      Флуктуационный и кросс-корреляционный анализ движений белков, наблюдаемых при моделировании наносекундной молекулярной динамики

      .

      Дж. Мол. биол.

      1995

      ;

      252

      :

      492

      –

      503

      .

      24.

      Тарантино

      Н.

      ,

      Тиневез

      Д.Ю.

      ,

      Crowell

      E.F.

      ,

      Boisson

      B.

      ,

      Henriques

      R.

      ,

      Mhlanga

      M.

      ,

      Agou

      F.

      ,

      Израиль

      A.

      ,

      Лаплантин

      E.

      TNF и IL-1 проявляют различную потребность в убиквитине для индукции надмолекулярных структур NEMO-IKK

      .

      J. Cell Biol.

      2014

      ;

      204

      :

      231

      –

      245

      .

      25.

      Негембор

      М.В.

      ,

      Себастьян-Перес

      Р.

      ,

      Aulicino

      F.

      ,

      Gomez-Garcia

      P.A.

      ,

      Косма

      М.П.

      ,

      Lakadamyali

      M.

      (Po)STAC (Polycistronic SunTAg, модифицированный CRISPR) обеспечивает визуализацию множества генов в сверхвысоком разрешении для живых и фиксированных клеток

      .

      Рез. нуклеиновых кислот.

      2018

      ;

      46

      :

      е30

      .

      26.

      Soutoglou

      E.

      ,

      Misteli

      T.

      Подвижность и неподвижность хроматина при транскрипции и стабильность генома

      .

      Курс. мнение Жене. Дев.

      2007

      ;

      17

      :

      435

      –

      442

      .

      27.

      Lanctot

      C.

      ,

      Cheutin

      T.

      ,

      Cremer

      M.

      ,

      Cavalli

      G.

      ,

      Cremer

      T.

      Динамическая архитектура генома в ядерном пространстве: регуляция экспрессии генов в трех измерениях7 .

      Нац. Преподобный Жене.

      2007

      ;

      8

      :

      104

      –

      115

      .

      28.

      Сахл

      С.Дж.

      ,

      Ад

      С.В.

      ,

      Джейкобс

      S.

      Флуоресцентная наноскопия в клеточной биологии

      .

      Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол.

      2017

      ;

      18

      :

      685

      –

      701

      .

      29.

      Коэн

      С.

      ,

      Валм

      А.М.

      ,

      Lippincott-Schwartz

      J.

      Мультиспектральная визуализация живых клеток

      .

      Курс. протокол Клеточная биол.

      2018

      ;

      79

      :

      e46

      .

      © Автор(ы), 2019 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

      Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно цитируется.

      © Автор(ы), 2019 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

      Субъект

      Клеточная биологияЦеленаправленная генная модификацияХроматин и эпигенетика

      Раздел выпуска:

      Методы онлайн

      Скачать все слайды

    • Дополнительные данные

      • Дополнительные данные

      gkz752_Supplemental_Files — zip файл

      Реклама

      Цитаты

      Альтметрика

      Дополнительная информация о метриках

      Оповещения по электронной почте

      Оповещение об активности статьи

      Предварительные уведомления о статьях

      Оповещение о новой проблеме

      Оповещение о теме

      Получайте эксклюзивные предложения и обновления от Oxford Academic

      Ссылки на статьи по телефону

      • Последний

      • Самые читаемые

      • Самые цитируемые

      CohesinDB: обширная база данных для расшифровки связанных с когезином эпигеномов, трехмерных геномов и транскриптомов в клетках человека

      Регуляторная сеть, включающая миРНК let-7 и SMUG1, связана с хорошим прогнозом при опухолях молочной железы ER +

      SIAh3 регулирует резекцию концов ДНК и восстановление репликационной вилки, способствуя убиквитинированию CtIP

      Массивно-параллельный репортерный анализ выявляет сфокусированные и широко закодированные сигналы локализации РНК в нейронах

      Модель репарации перекрестных связей ДНК с базовым сайтом; от архитектуры ДНК-связывающих доменов NEIL3 до модели X-структуры

      Реклама

      событий – сообщество FRET

      1 Предстоящие события — МАФ 2022

      2 Прошедшие события

      3 FRET конференции

      Предстоящие мероприятия — MAF 2022

      Сателлитный семинар на конференции «Методы и приложения во флуоресценции» (MAF) в Гётеборге, Юго-Восточная Америка (14–15 сентября 2022 г. )

      Сателлитное совещание FRET призвано объединить широкое сообщество FRET и предоставить более глубокое представление о последних разработках в этой области. Чтобы охватить широкий спектр приложений FRET, совещание разделено на три сессии:

      1. конфокальный smFRET для извлечения динамики,
      2. динамика из поверхностно-иммобилизованного smFRET,
      3. ДНК-нанотехнологии и биосенсор.

      Помимо приглашенных лекций старших докладчиков, есть время, зарезервированное для избранных коротких выступлений младших и молодых исследователей.

      Начинающим докладчикам предлагается отправить свои тезисы на [email protected] до 5 июня (формат A5 в формате pdf, тема электронной почты: FRET Abstract). О решении оргкомитета вы будете проинформированы до 10 июня.

      Прошлые события

      Деловые встречи

      Деловая встреча состоялась на собрании Биофизического общества в Сан-Диего, Калифорния, 15 февраля с 11-12. Во время встречи обсуждались текущие усилия сообщества и будущие направления. Видеотрансляция встречи доступна ниже.

           Outline:

      1. Общее введение и обзор выборов (Клаус Зайдель) 0:00–7:00
      2. Веб-сайт сообщества FRET: Настоящее и будущее (Андерс Барт) 7:00–15:00
      3. Прошлое и будущие собрания FRET (Хьюго Санабрия) 15:00–20:00
      4. Выборы консультативного совета (Дон С. Лэмб) 20:00–30:00
      5. Проблемы сообщества FRET I: Белки (Дон С. Лэмб) 31: 00–34:00
      6. Задачи сообщества FRET II: kinSoftChallenge (Андерс Барт) 34:00–36:00
      7. Будущие направления сообщества: Обзор заявлений о миссии (Джелле Хендрикс) 36:00-40:00
      8. Открытая дискуссия: Повестка дня дополнительной встречи на MAF2020 40:00-50:00
      9. Открытая дискуссия: Будущие встречи в БПС 50:00-60:00

      Сателлитные семинары

      Сателлитный семинар был проведен на встрече «Методы и приложения во флуоресценции» в Калифорнийском университете в Сан-Диего, 19-20 августа, с целью обеспечения распространения для начинающих и средних пользователей FRET и обсуждения усилий сообщества. В первый день лекции представили исторический контекст открытия и математическое описание FRET и обсудили различные подходы к измерению FRET на уровне отдельных молекул и визуализации живых клеток. Кроме того, на секционных заседаниях обсуждались практические аспекты проведения измерений, подготовки образцов и рабочего процесса анализа данных в одномолекулярном FRET на основе раствора. Во второй день были представлены различные подходы к измерению динамики в одномолекулярной FRET и корреляционной спектроскопии изображений от наносекунд до секунд-минут. В ходе переговоров обсуждались эксперименты FRET с вирусами, аналогами флуоресцентных оснований и комбинация FRET и микроскопии сверхвысокого разрешения.

      Satellite Meetings

      FRET по биофизике в BPS 2019

      Дискуссионный форум был задуман для того, чтобы сплотить научное сообщество, проявляющее особый интерес к методам количественной флуоресценции, с упором на резонансную передачу энергии Фёрстера (FRET). Экспертам было предложено представить различные точки зрения на (i) количественную визуализацию FRET, (ii) будущие возможности для количественного FRET, (iii) мнение пользователей о FRET, (iv) FRET для кинетического анализа и (v) проблемы в разработке программного обеспечения. с упором на интероперабельность. Участники дискуссии подчеркнули силу спектроскопии флуоресцентных изображений для решения сложных клеточных биофизических вопросов, представили передовые разработки в области одномолекулярного FRET, сообщили о проблеме, связанной с предоставлением неспециалистам возможности использовать флуоресценцию в качестве аналитического метода, а также о необходимости общелабораторных исследований. задокументированная реализация опубликованных и протестированных алгоритмов и форматов обмена данными для интегративного моделирования на основе флуоресценции и функционального программного обеспечения. Коротким презентациям предшествовал опрос сообщества о проблемах FRET: действия, которые служат для установления рекомендуемых процедур, проверки алгоритмов и передачи количественного аспекта FRET в пользу сообщества FRET. В ходе открытой панельной дискуссии участники согласились с тем, что (i) организованное распространение знаний, (ii) рекомендации, проверки и обмен данными без ущемления научной свободы, (iii) и более активное участие на местах необходимы для дальнейшего развитие области.

      Конференции FRET

      По случаю 100-летия со дня его рождения и 65 лет после его первой публикации о резонансной передаче энергии в 2011 году в Геттингене, Германия, состоялась первая международная встреча, посвященная резонансной передаче энергии Фёрстера в науках о жизни. чтобы почтить достижения профессора Теодора Фёрстера, отметив FRET как часть его богатого научного наследия на его первоначальном месте. В 2016 году заседание FRET было возобновлено и вновь проведено в Геттингене. Более подробную информацию можно найти здесь.

      Программное обеспечение для визуализации биосенсоров FRET на решетчатом световом листе, проиллюстрированное новым биосенсором Rap1 | Журнал клеточной биологии

      Skip Nav Destination

      Инструменты| 23 августа 2019 г.

      Эллен К. О’Шонесси,

      Оррин Дж. Стоун,

      Пол К. Лафосс

      ,

      Михай Л. Азойтей,

      Денис Цыганков

      ,

      Джон М. Хеддлстон

      ,

      Уэсли Р. Легант,

      Эрика С. Виттхен

      ,

      Кит Берридж

      ,

      909:20 Тимоти С. Элстон,

      Эрик Бетциг,

      Тенг-Леонг Чу,

      Дэвид Адальстейнссон,

      Клаус М. Хан

      Информация об авторе и статье

      Переписка с Дэвидом Адалстейнссоном: [email protected]

      Клаус М. Хан: [email protected]

      П.К. Нынешний адрес Лафосса: Национальные институты психического здоровья, Бетесда, Мэриленд.

      Нынешний адрес W.R. Legant: факультеты фармакологии и биомедицинской инженерии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, Чапел-Хилл, Северная Каролина.

      Нынешний адрес Э. Бетцига: Факультет физики Калифорнийского университета, Беркли, Беркли, Калифорния.

      Полученный: 04 марта 2019 г.

      Полученная редакция: 28 июня 2019 г.

      Принято: 25 июля 2019 г.

      Номер в сети: 1540-8140

      Номер для печати: 0021-9525

      Финансирование

      Фонд Гордона и Бетти Мур (БЕЗ НАГРАДА)

      Медицинский институт Говарда Хьюза (БЕЗ НАГРАДА)

      Национальные институты здоровья (HD083185)

      Министерство обороны США (W911NF-15-1-0631/A16-0438-001)

      © 2019 O’Shaughnessy et al.

      2019

      Эта статья распространяется на условиях лицензии Attribution-Noncommercial-Share Alike-No Mirror Sites в течение первых шести месяцев после даты публикации (см. http://www.rupress.org/terms/). Через шесть месяцев он доступен по лицензии Creative Commons (лицензия Attribution–Noncommercial–Share Alike 4.0 International, как описано на странице https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/).

      J Cell Biol (2019) 218 ​​(9): 3153–3160.

      https://doi.org/10.1083/jcb.2019

      История статьи

      Получено:

      04 марта 2019 г.

      Редакция Получено:

      28 июня 2019 г.

      Принято:

      25 июля 2019 г. Стандартный вид

    • Просмотры
      • Содержание артикула
      • Рисунки и таблицы
      • Видео
      • Аудио
      • Дополнительные данные
      • Экспертная оценка
    • PDF
    • Делиться
      • MailTo
      • Твиттер
      • LinkedIn
    • Инструменты

      • Получить разрешения

      • Иконка Цитировать Цитировать

    • Поиск по сайту

    Citation

    Эллен К. О’Шонесси, Оррин Дж. Стоун, Пол К. Лафосс, Михай Л. Азойтей, Денис Цыганков, Джон М. Хеддлстон, Уэсли Р. Легант, Эрика С. Виттхен, Кит Берридж, Тимоти С. , Элстон, Эрик Бетциг, Тенг-Леонг Чу, Дэвид Адалстейнссон, Клаус М. Хан; Программное обеспечение для визуализации биосенсоров FRET на решетчатом световом листе, проиллюстрированное новым биосенсором Rap1. J Cell Biol 2 сентября 2019 г.; 218 (9): 3153–3160. doi: https://doi.org/10.1083/jcb.2019

    Скачать файл цитаты:

    • Ris (Zotero)
    • Менеджер ссылок
    • EasyBib
    • Подставки для книг
    • Менделей
    • Бумаги
    • КонецПримечание
    • РефВоркс
    • Бибтекс
    панель инструментов поиска

    Расширенный поиск

    Решетчатая световая микроскопия (LLSM) ценна благодаря сочетанию сниженного фотообесцвечивания и выдающегося пространственно-временного разрешения в 3D. Использование LLSM для визуализации биосенсоров в живых клетках может обеспечить беспрецедентную визуализацию быстрых локальных изменений в конформации белка или посттрансляционной модификации. Однако вычислительные манипуляции, необходимые для визуализации биосенсора с помощью LLSM, сложны для многих пакетов программного обеспечения. Расчеты требуют обработки больших объемов данных даже для простых изменений, таких как переориентация визуализации ячеек или тестирование эффектов, выбираемых пользователем настроек, а отображение решетки создает уникальные проблемы при пороговой обработке и отображении отношений. Мы описываем здесь новый программный пакет под названием ImageTank, который специально разработан для практической визуализации биосенсоров с использованием LLSM. Чтобы продемонстрировать его возможности, мы используем новый биосенсор для изучения быстрой трехмерной динамики небольшой GTPase Rap1 в везикулах и клеточных выступах.

    Темы:

    Сотовая сигнализация, Технология

    Решетчатая световая микроскопия (LLSM) обеспечивает уникальное сочетание возможностей. Он может быстро создавать серию флуоресцентных изображений с разрешением до 220 × 220 × 370 нм и со значительно сниженным фотообесцвечиванием по сравнению с другими методами трехмерной флуоресцентной визуализации (Chen et al., 2014). LLSM уже позволил значительно улучшить представление о множественном поведении клеток и организмов (Strom et al., 2017; Valm et al., 2017; McArthur et al., 2018). Использование LLSM вместе с флуоресцентными биосенсорами может еще больше расширить его возможности, выявляя не только локализацию белка, но и активность белков в режиме реального времени. Биосенсорная визуализация может количественно определять динамику различных событий активации, включая конформационные изменения, события фосфорилирования, расщепление и взаимодействия связывания (Goguen and Imperiali, 2011; Mehta and Zhang, 2011; Zhang et al., 2018). Однако количественная оценка активности биосенсора требует обширной обработки изображений, что особенно сложно для LLSM из-за огромного объема данных, генерируемых этим методом, и интенсивных вычислительных операций, необходимых для количественной оценки активности белка на основе данных биосенсора. Это привело нас к разработке скриптов, специфичных для LLSM, на языке графического программирования DataTank (https://www.visualdatatools.com), чья высокоэффективная архитектура хорошо подходила для задач визуализации LLSM. Первоначальный успех этого подхода побудил нас разработать новое программное обеспечение для обработки изображений, ImageTank, чтобы включить эффективность, присущую этому языку программирования, в удобные графические пользовательские интерфейсы для количественной оценки и визуализации активности биосенсоров в 3D с течением времени. Эти сценарии были разработаны специально для данных LLSM, но их можно адаптировать и к другим модальностям визуализации.

    Чтобы использовать возможности LLSM, мы разработали новый биосенсор для небольшой GTPase Rap1. Rap1 координирует очень разнообразные клеточные процессы и, как полагают, опосредует связь между взаимодействием интегрина на вентральной поверхности и отдаленными динамическими рябями (Arthur et al., 2004; Takahashi et al. , 2008; Miyata et al., 2009). Используя быструю 3D-визуализацию активности Rap1, мы количественно оценили одновременную регуляцию Rap1 в этих разных локализациях и идентифицировали связи между активацией на вентральной поверхности и в периферических складках.

    Мы разработали двухцепочечный (межмолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера [FRET]) биосенсор для Rap1 (репортер флуоресцентной активности Rap1 [FLARE]), состоящий из Rap1, слитого на N-конце с акцепторным флуорофором, mCerulean3 (Markwardt et al., 2011 ), и Rap1-связывающий домен (RBD) эффекторного белка RalGDS, слитый с акцепторным флуорофором YPet (Nguyen and Daugherty, 2005; Fig. 1A). Использование двухцепочечных биосенсоров может быть осложнено межклеточными вариациями относительного уровня экспрессии двух цепей. Чтобы преодолеть это, мы разработали оптимизированную последовательность вируса 2A, которая экспрессировала оба белка из одной мРНК, что значительно снизило вариабельность относительной стехиометрии сенсорных цепей (рис. 1B). Rap1 FLARE был подтвержден путем тестирования взаимодействия конститутивно активных и доминантно-негативных мутантов (рис. 1C), его реакции на нативные регуляторы (рис. 1D), эффектов мутаций, которые изменяют взаимодействие RBD-Rap1 (рис. 1E), и ответы в живых клетках (рис. 1, F и G). Важно отметить, что конструкция с двойной цепью давала нулевой FRET в выключенном состоянии, что в сочетании с яркими флуорофорами приводило к чувствительному репортеру активности и упрощало размещение флуорофоров для максимальной эффективности FRET. Используя этот биосенсор, мы визуализировали клетки Cos7, когда они мигрировали по покровным стеклам, покрытым фибронектином. Мы приобрели 199 срезов на клетку, и для каждого среза мы одновременно собирали FRET (донорное возбуждение / акцепторное излучение) и CFP на двух комплементарных камерах металл-оксид-полупроводник (sCMOS), а затем собирали YFP для коррекции протекания (рис. 2). Общее время сбора на момент времени составляло ~8 с, и мы получили 90–180 карт активности целых клеток за 11,8–24,2 мин, включая до 30 ГБ данных на клетку.

    Из-за больших объемов данных, которые необходимо было обработать для получения изображений биосенсора в 3D, было важно эффективно обрабатывать данные. Нам нужно было использовать подход, который не будет повторять вычисления всякий раз, когда пользователь изменяет рутинные параметры визуализации (например, вращение, открытый срез или масштабирование). Поэтому сгенерированные нами сценарии сохраняли промежуточные результаты в памяти, чтобы избежать повторных вычислений, и автоматически очищали результаты при изменении входных данных. Если ввод не изменился, программа возвращала сохраненный результат, а не пересчитывала сложные задачи. Функциональные задачи были классифицированы на основе их сложности во время выполнения, относительных размеров входных/выходных данных и повторения вызовов функций. На основании этих свойств и вычислительных потребностей рабочего процесса данные выбирались для хранения либо в памяти (быстро), либо на диске (медленно). Это позволило нам редактировать параметры в любом месте рабочего процесса и немедленно визуализировать или анализировать количественные результаты без повторного расчета задач, на которые не повлияло это изменение. Все файлы изображений, связанные с данной ячейкой, были преобразованы в единый оптимизированный файл, который включал необработанные данные из каждого канала сбора данных, настройки микроскопа, файлы конфигурации и соответствующую информацию об обработке. Эти данные хранились в больших смежных блоках для ускорения чтения/записи и не содержали лишней служебной информации, которая есть в стандартных файлах .tif. Скрипты выполняют коррекцию плоского поля, регистрацию, вычитание фона, коррекцию фотообесцвечивания (Hodgson et al., 2006), коррекцию просачивания и определение порога (рис. 2) на данных 4D-биосенсора (Hodgson et al., 2010). Они позволяют непрерывно воспроизводить видео даже во время манипуляций с данными, отображать активность белка в виде твердого трехмерного объема, который можно анализировать в любой плоскости, и одновременно отображать несколько поверхностей или интересующих элементов. Кроме того, эти модульные сценарии могут быть расширены для включения дополнительного анализа либо с помощью внешних функций, закодированных в python, но работающих в ImageTank, либо путем экспорта данных в виде файлов . mat (MATLAB) или .xlsx (Excel).

    После выполнения стандартных коррекций изображения биосенсорная активность была рассчитана для всего куба данных, и клетка была сегментирована. Сегментация или определение границы ячейки была сложной задачей, поскольку оси куба данных не являются ортогональными, а разрешение различается по x, y и z. В нашем подходе к сегментации мы предположили, что в основе лежит непрерывная функция интенсивности в 3D, которая дискретизируется в масштабе вокселя. Пользователь определяет пороговые значения для отдельных 2D-срезов, чтобы создать функцию пороговых интенсивностей в пространстве. Эта пороговая функция использовалась для визуализации трехмерного объема ячеек посредством тесселяции с использованием алгоритма марширующих кубов (Лоренсен и Клайн, 19).87; Рис. S1). Эта процедура интерполировала треугольные плоскости между центрами вокселей, чтобы создать полную связную поверхность с субпиксельной точностью. В отличие от метода сегментации на основе пикселей, тесселяция более точно фиксирует край ячейки даже на изображениях с более низким отношением сигнал/шум (рис. S2). При разработке этой схемы мы решили установить пороги на основе флуоресцентного белка YPet из биосенсора вместо использования отдельного мембранного маркера, чтобы сохранить дополнительные каналы флуоресценции для будущих исследований мультиплексирования. Использование тесселяции было необходимо для этого процесса, потому что в некоторых частях клетки края были не так четко определены, как при использовании мембранного маркера или как при широкопольной микроскопии с изображениями более высокой интенсивности. Ключевым преимуществом LLSM является уменьшение фотообесцвечивания, что позволяет пролонгировать визуализацию более низких концентраций биосенсора, которые не нарушают клеточную биологию.

    Автоматическая сегментация клеток была одной из самых сложных задач при работе с этими данными. Мы исследовали методы на основе гистограмм, градиентов и адаптивные методы, но ни один из них не смог зафиксировать все различные особенности образцов. Наиболее успешно мы использовали подход, основанный на гистограмме, для данных после деконволюции, но когда мы нанесли полученные контуры на данные без деконволюции, мы не были уверены в наложении. Визуальная оценка изменения пороговых значений как в пространстве, так и во времени, хотя и была утомительной, была наиболее надежным методом сегментации клетки. Мы уверены в характеристиках клеток, которые мы описываем, поскольку мы неоднократно тестировали влияние различных пороговых значений. Мы продолжаем работать над автоматизированными методами для реализации в будущих версиях программного обеспечения.

    Изображения, полученные в LLSM, располагались под углом 31,8° к покровному стеклу, и их необходимо было исправить и интерполировать, чтобы отобразить объект с правильными размерами и обычной ориентацией (Chen et al., 2014; рис. 2). Чтобы сопоставить трехмерную сетку данных исходного изображения с физически точной новой сеткой, мы применили полное преобразование, скорректировав угол и физическое расстояние между срезами, которое определялось размером шага во время сбора данных. После устранения перекоса мы использовали интерполяцию на заданной пользователем сетке для создания сплошного трехмерного объекта, который можно было анализировать в любой плоскости. Размер шага в LLSM был достаточным для точной интерполяции информации между срезами, что позволило нам измерить интересующие особенности в физических единицах. Удобные графические пользовательские интерфейсы, связанные с каждым этапом процесса, были закодированы как модульные компоненты, которые могут быть включены пользователями по мере необходимости и могут применяться к любой технике 4D-визуализации.

    Вычислительные подходы были разработаны и оптимизированы с использованием биосенсора Rap1 в рамках экспериментальных исследований. Это ясно продемонстрировало способность LLSM обнаруживать быструю трехмерную динамику и визуализировать корреляции между даже краткими событиями активации по всей клетке. Было обнаружено, что Rap1 связан с внутриклеточными везикулами, которые происходят из (Video 1) и сливаются с (Video 2) вентральной и дорсальной клеточными мембранами (Fig. 3). Он также был замечен в спинных складках (рис. 4 и видео 3 и 4), в боковых выступах (видео 5) и под клеткой (рис. S3). Клетки высевали на фибронектин для стимуляции индуцированных интегрином выпячиваний. В соответствии с предыдущими исследованиями, показывающими, что Rap1 опосредует активацию интегрина и контроль протрузий (Arthur et al., 2004; Takahashi et al., 2008; Miyata et al., 2009).), во время наших наблюдений мы наблюдали активацию Rap1 на больших участках вентральной клеточной поверхности. Напротив, активация в рябах была быстрой и преходящей и включала в себя поразительные локальные всплески активности, которые было бы трудно охарактеризовать без превосходного пространственно-временного разрешения LLSM (рис. 4 и видео 3 и 4). В некоторых случаях были непрерывные «мосты» активированного Rap1, соединяющие вентральную мембрану с дорсальными складками (видео 6). Rap1 активировался в двух различных типах везикул (Fig. 3). В 25% клеток мы видели движущиеся везикулы с очень низкой активностью Rap1 в их центре, но частичную оболочку с высокой активностью по периферии. Эти везикулы (диаметром 1,2–4,4 мкм) с морфологией, наводящей на мысль о макропиносомах, образуются либо с вентральной, либо с дорсальной поверхности и в некоторых случаях возникают из складок на клетке (видео 7). 42% клеток содержали крупные (1,5–4,7 мкм) продолговатые тела с активным Rap1 на всем протяжении. Они были преимущественно перинуклеарными и вращались вокруг ядра (видео 8). Размеры этих пузырьков были рассчитаны с использованием разработанного нами набора измерительных инструментов (рис. S4).

    Таким образом, мы предлагаем индивидуальный вычислительный подход и удобное программное обеспечение для изучения биосенсоров с LLSM. Эффективность, заложенная в эти вычислительные инструменты, применима к другим методам 4D-изображения, а также к различным конструкциям биосенсоров. Сила объединения LLSM с биосенсорами была продемонстрирована с использованием нового биосенсора Rap1. Мы предоставили доказательства того, что активированный Rap1 является мессенджером, несущим информацию от мест активации интегрина к дорсальным выпячиваниям, показали быструю динамику Rap1 в рюшах со сложной трехмерной геометрией и показали различные типы везикул, содержащих активированный Rap1.

    Биосенсор Rap1

    Биосенсор Rap1 был клонирован в вектор экспрессии pTriEx4 (Novagen). Эффектор-связывающий домен Rap1 RalGDS (743–830) был помечен на С-конце акцепторным флуорофором YPet (Nguyen and Daugherty, 2005), разделенным коротким линкером, tccggaggatccggttcactcgag . Полноразмерный Rap1 был помечен с N-конца донорным флуорофором mCerulean3 (Markwardt et al., 2011), разделенным линкером SGLRSRAKL. Мы используем термины «CFP» и «YFP» в сценариях для обозначения в целом вариантов донорного и акцепторного флуоресцентных белков, которые обычно используются в наших биосенсорах FRET. Другие имена могут быть заменены по мере необходимости. Экспрессия обоих компонентов биосенсора из одной мРНК была опосредована тандемными последовательностями вируса 2A свиного тешовируса-1 (P2A) и Вирус Tesa asigna (T2A; Kim et al., 2011), разделенный линкером LQRPNSKKTSNSQKIN. Rap1 помещали ниже последовательности вируса 2A, чтобы сохранить нативную регуляцию гипервариабельной области.

    Валидация биосенсоров

    Биосенсоры были валидированы с использованием описанного ранее анализа на планшетах (Slattery and Hahn, 2014). Вкратце, клетки LinXE 293T помещали в 96-луночные планшеты и временно трансфицировали соответствующими конструкциями с использованием реагента липофектамина (50470; Invitrogen). Клетки инкубировали в течение 16–24 часов, визуализировали с использованием объектива 10× (0,3 NA; воздух; Olympus) с управляющим программным обеспечением MetaMorph (Molecular Devices) и анализировали с помощью пользовательских сценариев MATLAB (MathWorks). Для измерения скорректированного соотношения FRET для конститутивно активных (G12V) и доминантно-негативных (S17N) мутантов трансфицировали фиксированное количество ДНК (5 нг) для экспрессии mCerulean3-Rap1 (WT, конститутивно активный или доминантно-негативный) вместе с титрование RalGDS-YPet на несколько порядков (0,19–50 нг). Для обеспечения возможности сравнения чашек, полученных в разные дни с помощью разных микроскопов, каждая чашка содержала по крайней мере две повторности мутанта G12V, и вся чашка была нормализована к среднему максимальному FRET мутанта G12V (12–13 повторов, пять чашек, 3 г). Ошибка сообщается как SEM. Для количественной оценки регуляции фактором обмена гуаниновых нуклеотидов (CalDAG-GEF1) и белком, активирующим ГТФазу (Rap1GAP1), трансфицировали фиксированное количество (10 нг) биосенсора WT Rap1, экспрессированного вирусной последовательностью 2A (см. Регулятор Rap1 титровался на несколько порядков (0,39–100 нг). Каждый планшет нормализовали к среднему максимальному FRET титрования CalDAG-GEF1 (пять повторов, четыре планшета, 2 дня). Ошибка сообщается как SEM. Были введены точечные мутации, которые, как известно, отменяют связывание RalGDS с Rap1 (K48A, h59A), и RalGDS(K48A/h59A)-YPet, RalGDS(K48A)-YPet или RalGDS-YPet титровали против фиксированного количества mCerulean3-Rap1G12V. Каждая чашка была нормализована к среднему максимальному значению FRET RalGDS-YPet (12 повторов, шесть чашек, 2 дня), а самая высокая концентрация была показана в виде графика с прямоугольниками и усами. На графике прямоугольника и усов середина прямоугольника — это медиана, края прямоугольника — первая и третья квартили, а линии за пределами прямоугольника — минимальное и максимальное значения.

    Стимуляция и широкоугольная визуализация биосенсора Rap1

    Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) временно трансфицировали биосенсором WT Rap1 и смешивали 1:5 с нетрансфицированными клетками для получения индивидуально трансфицированных клеток, встроенных в монослой эндотелиальных клеток. Монослой снимали на Olympus IX81 с помощью камеры sCMOS (Hamamatsu Orca Flash 4.0) каждую минуту в течение пяти временных точек. Клетки стимулировали 100 мкМ 8-CPT-цАМФ и визуализировали еще в течение 16 временных точек. Биосенсорный анализ выполняли с помощью пользовательских сценариев MATLAB (MathWorks). Масштабирование изображений биосенсора рассчитывалось на основе значений в диапазоне от 95-й процентиль после стимуляции и 5-й процентиль до стимуляции. Среднее соотношение целых клеток для шести клеток и SEM определяли количественно с течением времени.

    Визуализация живых клеток с помощью LLSM

    LLSM

    Микроскопы LLSM, используемые в этих экспериментах, находятся в лаборатории Бецига и в Центре усовершенствованных изображений Медицинского института Говарда Хьюза, Исследовательский городок Джанелия. Клетки Cos7 временно трансфицировали биосенсорной плазмидой за 16–24 ч до визуализации с использованием Fugene6 (Promega). Клетки, используемые для визуализации живых клеток, высевали на покровные стекла (CS-5R; Warner Instruments), покрытые 10 мкг/мл фибронектина в среде Leibovitz L15, без фенолового красного (21083027; Thermo Fisher Scientific), содержащей 5% FBS. Система была настроена и работала, как описано ранее (Chen et al., 2014).

    Образцы облучали при 37°C диодным лазером с длиной волны 445 нм (Oxxius) с коэффициентом пропускания акустооптического перестраиваемого фильтра 60%, начальной мощностью лазера 50 мВт (2,75 мкВт в задней фокальной плоскости) и диодом с длиной волны 488 нм. лазер (MPB Communications) с коэффициентом пропускания акустооптического перестраиваемого фильтра 30 %, начальная мощность лазера 30 мВт (4,71 мкВт в задней фокальной плоскости), последовательное сканирование на пространственном модуляторе света (Fourth Dimension Displays) и фокусировка через объектив возбуждения (0,65 NA вод. иммерсионный; специальная оптика). Флуоресцентное излучение собирали с помощью детектирующего объектива (CFI Apo LWD 25XW, 1,1 NA; Nikon) и регистрировали с помощью sCMOS-камер (Hamamatsu Orca Flash 4.0 v2). Функции точечного рассеяния для каждой длины волны возбуждения были экспериментально измерены с использованием 200-нм тетраспек-гранул, приклеенных к покровным стеклам толщиной 5 мм (T7280; Invitrogen) в качестве прямой меры светового листа и оптического качества. Всего было получено 12 клеток из трех временных курсов в два отдельных дня: 180 точек времени, 8,12 с на объем клетки, общее время 24,2 мин; 120 точек времени, 8,12 с на объем ячейки, общее время 16,1 мин; и 90 точек времени, 7,96 с на объем ячейки, общее время 11,8 мин. Для работы с прибором и сбора данных использовалось программное обеспечение LabView (National Instruments).

    Анализ изображения

    Обработка биосенсором требует нескольких вычислительных шагов, которые различаются в зависимости от рассматриваемого биосенсора, настройки визуализации и плана эксперимента. Чтобы справиться с этими различными обстоятельствами, был разработан модульный сценарий обработки биосенсора, который позволяет пользователю выбирать дополнительные шаги обработки по мере необходимости (или добавлять дополнительные шаги, если это необходимо). Кроме того, данные из каждого модуля хранятся до тех пор, пока они не будут специально изменены, что позволяет пользователю сосредоточиться на заданном этапе процесса без необходимости пересчитывать предыдущие шаги. Эта схема управления данными облегчает быстрое исследование очень больших наборов данных. Сценарии состоят из модулей для организации необработанных данных, коррекции плоского поля, совмещения изображений, вычитания фона/коррекции фотообесцвечивания, сегментации, коррекции просачивания, а также визуализации и анализа биосенсоров. Обратите внимание, что Apple не поддерживает видеокарты NVIDIA в своей новейшей операционной системе MacOS 10.14. Эта проблема с драйвером повлияет на некоторые функции 3D-рендеринга ImageTank на старых компьютерах. Затронутые компьютеры включают некоторые модели 2013 года и одну модель 2014 года, хотя эти компьютеры не будут затронуты, если они работают под управлением MacOS 10.13 или более ранней версии.

    Организация необработанных данных

    Для облегчения быстрой обработки изображений необработанные файлы .tif были объединены в один непрерывный блок данных, который считывается в одном непрерывном потоке. Посторонняя информация, содержащаяся в заголовке .tif, была удалена, все каналы объединены в один файл, а срезы изображения организованы по оси Y для последующей обработки.

    Коррекция плоского поля

    Некоторое изменение интенсивности светового листа возбуждения очевидно в LLSM и может быть скорректировано путем получения изображения красителя с плоским полем во время экспериментальной установки или путем компьютерного определения плоского поля из большое количество наборов данных, полученных с одинаковыми экспериментальными условиями. Чтобы скорректировать изменение интенсивности возбуждения, необработанные изображения делятся на изображения плоского поля для конкретной длины волны, нормализованные к средней интенсивности 1,9.0057

    Регистрация изображения

    Для одновременной регистрации каналов CFP и FRET использовались две камеры, и регистрация требовалась для обеспечения правильного выравнивания этих изображений. Чтобы выполнить регистрацию, мы получили изображения бусинок, которые флуоресцируют как в каналах CFP, так и в каналах FRET (T7280; Invitrogen), чтобы одна и та же бусина могла быть получена обеими камерами. Мы идентифицировали одни и те же шарики на каждом изображении, нашли их центры и использовали эти точки для создания преобразования для сопоставления изображений CFP с изображениями FRET. Мы использовали полное преобразование, допускающее сдвиг, вращение и масштабирование, хотя при желании мы включили возможность преобразования перспективы. Расстояние между каждой парой шариков и среднее расстояние всех пар наносятся на график, чтобы показать качество подгонки и облегчить выбор оптимального преобразования.

    Вычитание фона и коррекция фотообесцвечивания

    Для выполнения обеих коррекций мы устанавливаем грубый порог для определения края ячейки. Пиксели за пределами порога считались фоном, и средняя интенсивность фона каждого канала вычиталась из этого канала. Для пикселей внутри ячейки строилась суммарная интенсивность в каждом канале во времени. Кривая затухания была подогнана к этим данным и использована для коррекции фотообесцвечивания (Hodgson et al., 2008, 2010). Каждый канал был разделен соответствующей кривой затухания, нормированной на начальное значение.

    Сегментация

    Мы решили сегментировать клетку на основе компонента биосенсора (RalGDS-YPet), чтобы уменьшить количество изображений, необходимых в каждый момент времени, и оставить каналы свободными для мультиплексирования. Нам нужно было использовать разные пороговые значения для каждого среза, поскольку срезы с низким содержанием цитозоля были тусклее, чем срезы в середине клетки. Для каждой клетки пороговое значение устанавливалось каждые 5 мкм, и функция подбиралась между указанными значениями. Дополнительные срезы были указаны, если необходимо, чтобы учесть большие изменения, а для некоторых ячеек пороговые значения были скорректированы с течением времени, поскольку тело ячейки значительно перемещалось. Используя функцию подгонки к заданным значениям, мы разделили каждое изображение в стеке YFP ​​на пороговое значение, присвоенное этому изображению, и интерполировали поверхность по значениям, равным 1,9.0057

    Коррекция проницаемости

    Некоторые конструкции биосенсоров, в том числе двухцепочечный (межмолекулярный) биосенсор, используемый здесь, требуют коррекции проницаемости. Измерение коэффициентов кровоизлияния подробно описано ранее (Hodgson et al. , 2010). Коэффициент α количественно характеризует протекание от донора в акцепторный канал, а коэффициент β количественно характеризует протекание от прямого возбуждения акцепторного флуорофора. Коэффициенты просачивания использовались для расчета скорректированного FRET (скорректированный FRET = FRET — α × CFP — β × YFP) и коэффициента активности (скорректированный FRET/CFP). И скорректированный FRET, и коэффициент активности рассчитывались для всего куба данных один раз, а затем отображались на всей поверхности ячейки, в области ячейки, в 2D-срезе или в дополнительной маске по желанию пользователя. .

    Наличие кода

    Программное обеспечение и сценарии ImageTank можно получить по адресу https://visualdatatools.com/ImageTank/.

    Сценарии ImageTank также доступны для загрузки на веб-сайте лаборатории Хана.

    Дополнительный онлайн-материал

    На рис. S1 показана демонстрация 3D-рендеринга поверхности с использованием тесселяции с использованием алгоритма марширующих кубов. Сравнение ошибки, связанной с сегментацией путем интерполяции или маскирования, показано на рис. S2. Виды дорсальной и вентральной поверхностей нескольких клеток можно увидеть на рис. S3. Они выявляют широкие области высокой активности вдоль дна клеток. Демонстрация инструмента измерения, используемого для количественной оценки размера внутренних структур, показана на рис. S4. На видео 1 показан везикул, выходящий из вентральной клеточной мембраны. На видео 2 показано слияние везикулы с вентральной клеточной мембраной. Видео 3 показывает активацию Rap1 внутри оборки. Видео 4 показывает активацию Rap1 внутри оборки. Видео 5 показывает высокую активность Rap1 в выступах, если смотреть снизу клетки. На видео 6 показано движущееся поперечное сечение рюши в один момент времени. Обратите внимание, что активность, лежащая в основе взъерошенности, распространяется в некоторых точках на вентральную поверхность. На видео 7 показана везикула, образованная складчатой ​​складкой. На видео 8 видно, что внутренние области высокой активности вращаются против часовой стрелки.

    Мы благодарим Национальные институты здравоохранения (R35GM122596 и R01HL133668) и Министерство обороны США (W911NF-15-1-0631/A16-0438-001) за их поддержку. Центр усовершенствованной визуализации спонсируется совместно Медицинским институтом Говарда Хьюза и Фондом Гордона и Бетти Мур.

    Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

    Вклад авторов: Э. К. О’Шонесси изготовил биосенсор Rap1 и возглавил экспериментальную работу. Э.С. Виттхен и К. Берридж внесли свой вклад в тестирование биосенсора на живых клетках. К.М. Хан инициировал и руководил проектом. Э. К. О’Шонесси, Д. Адальстейнссон и К.М. Хан написал статью при участии всех авторов. Д. Адальстейнссон написал программное обеспечение при содействии П.К. Лафоссе и при участии К.М. Хан и Э. К. О’Шонесси. Т.Л. Чу и Дж. М. Хеддлстон предоставили инструмент LLSM в Центре усовершенствованной визуализации на ферме Джанелия и помогли провести там эксперименты. В. Р. Легант провел исследования LLSM в лаборатории Бетцига вместе с Э. К. О’Шонесси и М.Л. Азойтеи под руководством Э. Бетцига. О.Дж. Стоун и М.Л. Азойтеи провел первоначальные исследования биосенсоров, а Д. Цыганков провел первоначальную разработку программного обеспечения и подхода к анализу данных.

    Артур

    ,

    W.T.

    ,

    L.A.

    Купер

    .

    2004

    .

    Rap1 способствует распространению клеток за счет локализации факторов обмена гуаниновых нуклеотидов Rac

    .

    J. Cell Biol.

    167

    :

    111

    –

    122

    .

    https://doi.org/10.1083/jcb.200404068

    Чен

    ,

    до н. э.

    ,

    Вт.

    Милки

    ,

    M.W.

    Ву

    ,

    Дж.А.

    Молоток

    III,

    Z.

    Лю

    и др.

    2014

    .

    Решетчатая световая микроскопия: визуализация молекул эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением

    .

    Наука.

    346

    :1257998.

    https://doi.org/10.1126/science.1257998

    Goguen

    ,

    Б.Н.

    и

    Б.

    Империали

    .

    2011

    .

    Химические инструменты для изучения направленной миграции клеток

    .

    ACS Chem. биол.

    6

    :

    1164

    –

    1174

    .

    https://doi.org/10.1021/cb200299k

    Hodgson

    ,

    L.

    ,

    P.

    Nalbant

    ,

    F.

    Shen

    , and

    K.

    Хан

    .

    2006

    .

    Визуализация и фотокоррекция Mero-CBD, датчик эндогенной активации Cdc42

    .

    Методы Фермент.

    406

    :

    140

    –

    156

    .

    https://doi.org/10.1016/S0076-6879(06)06012-5

    Hodgson

    ,

    L.

    ,

    O.

    067

    777777777777777777777777777777777777777777777 год

    7777777777777777777777777777 гг.

    Хан

    .

    2008

    .

    Дизайн и оптимизация генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров: биосенсоры с ГТФазой

    .

    Методы Cell Biol.

    85

    :

    63

    –

    81

    .

    https://doi.org/10.1016/S0091-679X(08)85004-2

    Ходжсон

    ,

    Л.

    ,

    Ф.

    Шен060 К.

    Хан

    .

    2010

    .

    Биосенсоры для характеристики динамики ГТФаз семейства rho в живых клетках

    .

    Курс. протокол Клеточная биол.

    14

    :

    1

    –

    26

    .

    https://doi.org/10.1002/0471143030.cb1411s46

    Ким

    ,

    Дж.Х.

    ,

    С.Р.

    Ли

    ,

    Л.Х.

    Ли

    ,

    Х.Дж.

    Парк

    ,

    К.Ю.

    Ли

    ,

    М.К.

    Ким

    ,

    Б.А.

    Шина

    и

    С.Я.

    Чой

    .

    2011

    .

    Высокая эффективность расщепления пептида 2А, полученного из свиного тешовируса-1, в клеточных линиях человека, рыбок данио и мышей

    .

    PLoS Один.

    6

    :e18556.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018556

    Лоренсен

    ,

    З.Д.

    и

    H.E.

    Клайн

    .

    1987

    .

    Марширующие кубы: Алгоритм построения трехмерной поверхности с высоким разрешением

    .

    ACM SIGGRAPH Компьютерная графика

    21

    :

    163

    –

    169

    .

    https://doi.org/10.1145/37402.37422

    Markwardt

    ,

    М.Л.

    ,

    Г.Дж.

    Кремерс

    ,

    К.А.

    Крафт

    ,

    К.

    Рэй

    ,

    P.J.C.

    Крэнфилл

    ,

    К.А.

    Уилсон

    ,

    Р.Н.

    День

    ,

    Р.М.

    Wachter

    ,

    M.W.

    Davidson

    и

    MA

    Rizzo

    .

    2011

    .

    Улучшенный лазурный флуоресцентный белок с повышенной яркостью и уменьшенным обратимым фотопереключением

    .

    PLoS Один.

    6

    :e17896.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017896

    Макартур

    ,

    К.

    ,

    Л.В.

    Уайтхед

    ,

    Дж. М.

    Хеддлстон

    ,

    Л.

    Ли

    ,

    B.S.

    Padman

    ,

    V.

    Oorschot

    ,

    N.D.

    Geoghegan

    ,

    S.

    Chappaz

    ,

    S.

    Davidson

    ,

    H.

    Сан Чин

    и др.

    2018

    .

    Макропоры BAK/BAX облегчают митохондриальное вклинение и отток мтДНК во время апоптоза

    .

    Наука.

    359

    :eaao6047.

    https://doi.org/10.1126/science.aao6047

    Мехта

    ,

    С.

    и

    Дж.

    Чжан

    .

    2011

    .

    Репортажи с мест: генетически закодированные флуоресцентные репортеры раскрывают динамику передачи сигналов в живых биологических системах

    .

    год. Преподобный Биохим.

    80

    :

    375

    –

    401

    .

    https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060409-0

    Miyata

    ,

    M.

    ,

    Y.

    Rikitake

    ,

    M.

    Takahashi

    ,

    Ю.

    Нагамацу

    ,

    Ю.

    Ямаути

    ,

    Х.

    Огита

    ,

    К.

    Хирата

    и

    Ю. 72

    60 Така

    2009

    .

    Регуляция афадином циклической активации и инактивации малых G-белков Rap1, Rac1 и RhoA на передних краях движущихся клеток NIh4T3

    .

    Журнал биол. хим.

    284

    :

    24595

    –

    24609

    .

    https://doi.org/10.1074/jbc.M109.016436

    Нгуен

    ,

    А.В.

    и

    P.S.

    Догерти

    .

    2005

    .

    Эволюционная оптимизация флуоресцентных белков для внутриклеточного FRET

    .

    Нац. Биотехнолог.

    23

    :

    355

    –

    360

    .

    https://doi.org/10.1038/nbt1066

    Слэттери

    ,

    С.Д.

    и

    К.М.

    Хан

    .

    2014

    .

    Анализ с высоким содержанием для проверки биосенсоров и изучения стимулов, влияющих на активность биосенсоров

    .

    Курс. протокол Клеточная биол.

    65

    :

    1

    –

    31

    .

    https://doi.org/10.1002/0471143030.cb1415s65

    Стром

    ,

    А.Р.

    ,

    А.В.

    Емельянов

    ,

    М.

    Мир

    ,

    Д.В.

    Федоров

    ,

    X.

    Дарзак

    , и

    Г.Х.

    Карпен

    .

    2017

    .

    Разделение фаз приводит к образованию доменов гетерохроматина

    .

    Природа.

    547

    :

    241

    –

    245

    .

    https://doi.org/10.1038/nature22989

    Takahashi

    ,

    M.

    ,

    Y.

    Rikitake

    ,

    Y.

    Nagamatsu

    ,

    T.

    Хара

    ,

    В.

    Икеда

    ,

    К.

    Хирата

    и

    Ю.

    Такаи

    .

    2008

    .

    Последовательная активация малых G-белков Rap1 и Rac1 с помощью PDGF локально на передних краях клеток NIh4T3

    .

    Гены Клетки.

    13

    :

    549

    –

    569

    .

    https://doi.org/10.1111/j.1365-2443.2008.01187.x

    Valm

    ,

    A.M.

    ,

    С.

    Коэн

    ,

    Вт.

    Cohen

    ,

    M.W.

    Davidson

    ,

    E.

    Betzig

    , и

    J.

    606060602057

    J.

    606060602057

    7

    J.

    .

    2017

    .

    Применение спектральной визуализации и анализа на системном уровне для выявления интерактома органеллы

    .

    Природа.

    546

    :

    162

    –

    167

    .

    https://doi.org/10.1038/nature22369

    Zhang

    ,

    J.

    ,

    S.

    Mehta

    , and

    C.

    Schultz

    .

    2018

    .

    Оптические зонды в биологии.

    CRC Press

    ,

    Бока-Ратон, Флорида

    .

    Примечания автора

    П. К. Нынешний адрес Лафосса: Национальные институты психического здоровья, Бетесда, Мэриленд.

    Нынешний адрес W.R. Legant: факультеты фармакологии и биомедицинской инженерии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, Чапел-Хилл, Северная Каролина.

    Нынешний адрес Э. Бетцига: Факультет физики Калифорнийского университета, Беркли, Беркли, Калифорния.

    Дополнительные данные

    Дополнительные материалы (PDF) — файл в формате pdf

    данные и цифры

    Данные и цифры

    содержимое

    Содержимое

    добавки

    Дополнения

    ссылок

    Каталожные номера

    Рисунок 1.

    Биосенсор Rap1. (A) . Схема биосенсора Rap1, показывающая, что FRET возникает, когда Rap1, нагруженный GTP, связывает RBD, объединяя mCerulean3 (синий) и YPet (желтый). (B) Репрезентативный Вестерн-блоттинг, показывающий разделение обоих компонентов биосенсора, экспрессированных с использованием тандемных последовательностей вируса 2А. (C) Измерение ответа FRET биосенсора путем титрования компонента RBD постоянной концентрацией конститутивно активного (G12V), доминантно-негативного (S17N) и WT Rap1. Результаты получены из 12 (WT и S17N) или 13 (G12V) повторов полного титрования. Ошибка СЭМ. Для мутанта S17N не обнаруживается FRET. Это вместе с высокой эффективностью FRET позволило создать чувствительный биосенсор. Все анализы на планшетах проводили с клетками LinXe. (D) Биосенсор сообщил об активации при экспрессии с CalDAG-GEF1 и об инактивации при коэкспрессии с Rap1GAP1. Показаны результаты для n = 5 различных повторов. Ошибка СЭМ. (E) FRET был значительно снижен путем введения мутаций K48A или K48A/h59A в аффинный реагент RalGDS для прекращения связывания (график с решеткой и усами, n = 12). (F) Отдельные кадры активности биосенсора Rap1 в HUVEC с (правая панель) и без (левая панель) стимуляции низкомолекулярным активатором Epac, Rap1 GEF (8-CPT-цАМФ). Шкала баров, 10 мкм. (G) клеток HUVEC, экспрессирующих биосенсор, стимулировали 8-CPT-цАМФ (показаны серым цветом), и среднее соотношение клеток было нормализовано до 1 в первой точке времени ( n = 6 клеток, ошибка — стандартная ошибка среднего). .

    Рисунок 1.

    Биосенсор Rap1. (A) . Схема биосенсора Rap1, показывающая, что FRET возникает, когда Rap1, нагруженный GTP, связывает RBD, объединяя mCerulean3 (синий) и YPet (желтый). (B) Репрезентативный вестерн-блоттинг, показывающий разделение обоих компонентов биосенсора, экспрессированных с использованием тандемных последовательностей вируса 2А. (C) Измерение ответа FRET биосенсора путем титрования компонента RBD постоянной концентрацией конститутивно активного (G12V), доминантно-негативного (S17N) и WT Rap1. Результаты получены из 12 (WT и S17N) или 13 (G12V) повторов полного титрования. Ошибка СЭМ. Для мутанта S17N не обнаруживается FRET. Это вместе с высокой эффективностью FRET позволило создать чувствительный биосенсор. Все анализы на планшетах проводили с клетками LinXe. (D) Биосенсор сообщил об активации при экспрессии с CalDAG-GEF1 и об инактивации при коэкспрессии с Rap1GAP1. Результаты от n = показаны 5 различных повторов. Ошибка СЭМ. (E) FRET был значительно снижен путем введения мутаций K48A или K48A/h59A в аффинный реагент RalGDS для прекращения связывания (график с решеткой и усами, n = 12). (F) Отдельные кадры активности биосенсора Rap1 в HUVEC с (правая панель) и без (левая панель) стимуляции низкомолекулярным активатором Epac, Rap1 GEF (8-CPT-цАМФ). Шкала баров, 10 мкм. (G) клеток HUVEC, экспрессирующих биосенсор, стимулировали 8-CPT-цАМФ (показаны серым цветом), а среднее соотношение клеток нормализовали до 1 в первый момент времени ( n = 6 ячеек, ошибка SEM).

    Закрыть модальное окно

    Рис. 2.

    Рабочий процесс биосенсорной обработки данных LLSM. Программное обеспечение выполняет начальные этапы обработки изображения, включая коррекцию плоского поля, совмещение, вычитание фона, коррекцию фотообесцвечивания и коррекцию проступания. Из-за больших различий в значениях интенсивности на каждом срезе пороговое значение (определение границы ячейки) может быть выполнено вручную или с помощью функции, соответствующей изменяющимся значениям, заданным для ряда срезов и/или моментов времени. Поверхность ячейки определяется с помощью тесселяции, процесса, в котором край интерполируется на основе пороговых значений в скользящей локальной области. Мера активности (например, отношение FRET или общее скорректированное FRET [Corr. FRET]) определяется для всего поля зрения, а затем визуализируется поверхность на основе сегментации краев или других интересующих поверхностей. Преимущество этой схемы заключается в том, что без дополнительных вычислений изменения в сегментации могут быть немедленно обновлены, и одновременно могут быть показаны несколько поверхностей, таких как внешний край клетки и области высокой активности. После расчета показателей активности изображения выравниваются и интерполируются по заданной пользователем сетке для создания цельного трехмерного объема ячеек. Наконец, ImageTank включает сценарии для анализа биосенсорной активности в любой интересующей области или в любой плоскости клетки и для измерения этих областей или объектов в физически значимых единицах.

    Рис. 2.

    Рабочий процесс биосенсорной обработки данных LLSM. Программное обеспечение выполняет начальные этапы обработки изображения, включая коррекцию плоского поля, совмещение, вычитание фона, коррекцию фотообесцвечивания и коррекцию проступания. Из-за больших различий в значениях интенсивности на каждом срезе пороговое значение (определение границы ячейки) может быть выполнено вручную или с помощью функции, соответствующей изменяющимся значениям, заданным для ряда срезов и/или моментов времени. Поверхность ячейки определяется с помощью тесселяции, процесса, в котором край интерполируется на основе пороговых значений в скользящей локальной области. Мера активности (например, отношение FRET или общее скорректированное FRET [Corr. FRET]) определяется для всего поля зрения, а затем визуализируется поверхность на основе сегментации краев или других интересующих поверхностей. Преимущество этой схемы заключается в том, что без дополнительных вычислений изменения в сегментации могут быть немедленно обновлены, и одновременно могут быть показаны несколько поверхностей, таких как внешний край клетки и области высокой активности. После расчета показателей активности изображения выравниваются и интерполируются по заданной пользователем сетке для создания цельного трехмерного объема ячеек. Наконец, ImageTank включает сценарии для анализа биосенсорной активности в любой интересующей области или в любой плоскости клетки и для измерения этих областей или объектов в физически значимых единицах.

    Закрыть модальное окно

    Рис. 3.

    Активность Rap1 в различных типах везикулярных структур. (A) Приблизительно половина клеток Cos7 проявляла высокую активность Rap1, распространяющуюся на везикулярные структуры. Они были сосредоточены вокруг ядра. Цветовая шкала указывает скорректированное значение FRET/CFP, исключая самые высокие и самые низкие 2% значений соотношения для устранения паразитных пикселей. Масштабная линейка, 2,5 мкм. (B) 3 из 12 клеток показали структуры, частично окруженные оболочкой активности Rap1. Было замечено, что они как возникают, так и сливаются с вентральной и дорсальной поверхностями. Шкала баров, 2,5 мкм. (C) Поверхность клетки и деталь, нарисованная топографическими линиями для иллюстрации положения пузырька. Временной ряд показывает область клетки, разделенную пополам плоскостью, проходящей через везикулу, и соответствующей плоскостью на псевдоцветной карте активности Rap1. Везикула образована дорсальной бороздкой, сливающейся с верхушкой клетки. Шкала баров, 2,5 мкм.

    Рис. 3.

    Активность Rap1 в различных типах везикулярных структур. (A) Приблизительно половина клеток Cos7 проявляла высокую активность Rap1, распространяющуюся на везикулярные структуры. Они были сосредоточены вокруг ядра. Цветовая шкала указывает скорректированное значение FRET/CFP, исключая самые высокие и самые низкие 2% значений соотношения для устранения паразитных пикселей. Масштабная линейка, 2,5 мкм. (B) 3 из 12 клеток показали структуры, частично окруженные оболочкой активности Rap1. Было замечено, что они как возникают, так и сливаются с вентральной и дорсальной поверхностями. Шкала баров, 2,5 мкм. (C) Поверхность клетки и деталь, нарисованная топографическими линиями для иллюстрации положения пузырька. Временной ряд показывает область клетки, разделенную пополам плоскостью, проходящей через везикулу, и соответствующей плоскостью на псевдоцветной карте активности Rap1. Везикула образована дорсальной бороздкой, сливающейся с верхушкой клетки. Шкала баров, 2,5 мкм.

    Закрыть модальное окно

    Рис. 4.

    Rap1 динамика в оборках. (A) Оборки в левом верхнем углу (рамка) разрезаны плоскостями, показанными в разное время. Обратите внимание на изменение распределения активной активности Rap1 и Rap1 от вентральной поверхности до вершины складок (правая верхняя плоскость). Цветовая шкала указывает скорректированное значение FRET/CFP, исключая самые высокие и самые низкие 2% значений соотношения для устранения паразитных пикселей. Шкала баров, 5 мкм. (B) Вогнутый валик прорезан серией плоскостей, параллельных покровному стеклу, на увеличивающейся высоте над покровным стеклом. Самая высокая активность Rap1 наблюдается на поверхности ряби, обращенной в направлении движения (видео 4). Форма ряби видна на паттерне активности Rap1 на дне клетки Cos7 (самая нижняя плоскость). Масштабная линейка, 5 мкм. (C) Дорсальная бороздка разрезана единственной плоскостью, показывающей активность Rap1 по всей структуре и в соединениях с плотной областью высокой активности на дне клетки Cos7. Масштабная линейка, 5 мкм.

    Рис. 4.

    Rap1 динамика в оборках. (A) Оборки в левом верхнем углу (рамка) разрезаны плоскостями, показанными в разное время. Обратите внимание на изменение распределения активной активности Rap1 и Rap1 от вентральной поверхности до вершины складок (правая верхняя плоскость). Цветовая шкала указывает скорректированное значение FRET/CFP, исключая самые высокие и самые низкие 2% значений соотношения для устранения паразитных пикселей. Шкала баров, 5 мкм. (B) Вогнутая складка срезана серией плоскостей, параллельных покровному стеклу, на увеличивающейся высоте над покровным стеклом. Самая высокая активность Rap1 наблюдается на поверхности ряби, обращенной в направлении движения (видео 4). Форма ряби видна на паттерне активности Rap1 на дне клетки Cos7 (самая нижняя плоскость). Масштабная линейка, 5 мкм. (C) Дорсальная бороздка разрезана единственной плоскостью, демонстрирующей активность Rap1 по всей структуре и в соединениях с плотной областью высокой активности на дне клетки Cos7. Масштабная линейка, 5 мкм.

    Закрыть модальное окно

    • Предыдущая статья
    •  

    Артур

    ,

    W.T.

    ,

    Л.А.

    Купер

    .

    2004

    .

    Rap1 способствует распространению клеток за счет локализации факторов обмена гуаниновых нуклеотидов Rac

    .

    J. Cell Biol.

    167

    :

    111

    –

    122

    .

    https://doi.org/10.1083/jcb.200404068

    Чен

    ,

    до н.э.

    ,

    Вт.

    Милки

    ,

    МВт

    Дэвидсон

    ,

    К.

    Джанетопулос

    ,

    X.S.

    Ву

    ,

    Дж.А.

    Молоток

    III,

    Z.

    Лю

    и др.

    2014

    .

    Решетчатая световая микроскопия: визуализация молекул эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением

    .

    Наука.

    346

    :1257998.

    https://doi.org/10.1126/science.1257998

    Гоген

    ,

    Б.Н.

    и

    Б.

    Империали

    .

    2011

    .

    Химические инструменты для изучения направленной миграции клеток

    .

    ACS Chem. биол.

    6

    :

    1164

    –

    1174

    .

    https://doi.org/10.1021/cb200299k

    Ходжсон

    ,

    Л.

    ,

    P.

    Налбант

    ,

    F.

    Shen

    и

    K.

    Hahn5.

    2006

    .

    Визуализация и фотокоррекция Mero-CBD, датчик эндогенной активации Cdc42

    .

    Методы Фермент.

    406

    :

    140

    –

    156

    .

    https://doi.org/10.1016/S0076-6879(06)06012-5

    Ходжсон

    ,

    Л.

    ,

    О.

    Pertz

    , и

    9.0060 К.М.

    Хан

    .

    2008

    .

    Дизайн и оптимизация генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров: биосенсоры с ГТФазой

    .

    Методы Cell Biol.

    85

    :

    63

    –

    81

    .

    https://doi.org/10.1016/S0091-679X(08)85004-2

    Hodgson

    ,

    L.

    ,

    F.

    Shen

    , and

    K.

    Hahn

    .

    2010

    .

    Биосенсоры для характеристики динамики ГТФаз семейства rho в живых клетках

    .

    Курс. протокол Клеточная биол.

    14

    :

    1

    –

    26

    .

    https://doi.org/10.1002/0471143030.cb1411s46

    Ким

    ,

    Дж.Х.

    ,

    С.Р.

    Ли

    ,

    Л.Х.

    Ли

    ,

    Х.Дж.

    Парк

    ,

    К.Ю.

    Ли

    ,

    М.К.

    Ким

    ,

    Б.А.

    Шина

    и

    С.Я.

    Чой

    .

    2011

    909:20 .

    Высокая эффективность расщепления пептида 2А, полученного из свиного тешовируса-1, в линиях клеток человека, рыбок данио и мышей

    .

    PLoS Один.

    6

    :e18556.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018556

    Лоренсен

    ,

    З.Д.

    и

    H.E.

    Клайн

    .

    1987

    .

    Марширующие кубы: Алгоритм построения трехмерной поверхности с высоким разрешением

    .

    ACM SIGGRAPH Компьютерная графика

    21

    :

    163

    –

    169

    .

    https://doi.org/10.1145/37402.37422

    Markwardt

    ,

    М.Л.

    ,

    Г.Дж.

    Кремерс

    ,

    К.А.

    Крафт

    ,

    К.

    Рэй

    ,

    P.J.C.

    Крэнфилл

    ,

    К.А.

    Уилсон

    ,

    Р.Н.

    День

    ,

    Р.М.

    Wachter

    ,

    M.W.

    Davidson

    и

    MA

    Rizzo

    .

    2011

    .

    Улучшенный лазурный флуоресцентный белок с повышенной яркостью и уменьшенным обратимым фотопереключением

    .

    PLoS Один.

    6

    :e17896.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017896

    McArthur

    ,

    K.

    ,

    L.W.

    Уайтхед

    ,

    Дж. М.

    Хеддлстон

    ,

    Л.

    Ли

    ,

    B.S.

    Padman

    ,

    V.

    Oorschot

    ,

    Н.Д.0060 Чаппаз

    ,

    С.

    Дэвидсон

    ,

    Х.

    Сан Чин

    и др.

    2018

    .

    Макропоры BAK/BAX облегчают митохондриальное вклинение и отток мтДНК во время апоптоза

    .

    Наука.

    359

    :eaao6047.

    https://doi.org/10.1126/science.aao6047

    Мехта

    ,

    С.

    и

    Дж.

    Чжан

    .

    2011

    .

    Репортаж с мест: генетически закодированные флуоресцентные репортеры раскрывают динамику передачи сигналов в живых биологических системах

    .

    год. Преподобный Биохим.

    80

    :

    375

    –

    401

    .

    https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060409-0

    Мията

    ,

    М.

    ,

    Y.

    Rikitake

    ,

    M.

    Takahashi

    ,

    Y.

    Nagamatsu

    ,

    Y.

    Yamauchi

    ,

    H.

    Ogita

    ,

    К.

    Хирата

    и

    Ю.

    Такаи

    .

    2009

    .

    Регуляция афадином циклической активации и инактивации малых G-белков Rap1, Rac1 и RhoA на передних краях движущихся клеток NIh4T3

    .

    Журнал биол. хим.

    284

    :

    24595

    –

    24609

    .

    https://doi.org/10.1074/jbc.M109.016436

    Нгуен

    ,

    А.В.

    и

    P.S.

    Догерти

    .

    2005

    .

    Эволюционная оптимизация флуоресцентных белков для внутриклеточного FRET

    .

    Нац. Биотехнолог.

    23

    :

    355

    –

    360

    .

    https://doi.org/10.1038/nbt1066

    Слэттери

    ,

    С.Д.

    и

    К.М.

    Хан

    .

    2014

    .

    Анализ с высоким содержанием для проверки биосенсоров и изучения стимулов, влияющих на активность биосенсоров

    .

    Курс. протокол Клеточная биол.

    65

    :

    1

    –

    31

    .

    https://doi.org/10.1002/0471143030.cb1415s65

    Стром

    ,

    А.Р.

    ,

    А.В.

    Емельянов

    ,

    М.

    Мир

    ,

    Д.В.

    Федоров

    ,

    X.

    Дарзак

    , и

    Г.Х.

    Карпен

    .

    2017

    .

    Разделение фаз приводит к образованию доменов гетерохроматина

    .

    Природа.

    547

    :

    241

    –

    245

    .

    https://doi.org/10.1038/nature22989

    Takahashi

    ,

    M.

    ,

    Y.

    Rikitake

    ,

    Y.

    Nagamatsu

    ,

    T.

    HARA

    ,

    W.

    IKEDA

    ,

    K.

    Hirata

    и

    Y.

    TAKAI

    .

    2008

    .

    Последовательная активация малых G-белков Rap1 и Rac1 с помощью PDGF локально на передних краях клеток NIh4T3

    .

    Гены Клетки.

    13

    :

    549

    –

    569

    .

    https://doi.org/10.1111/j.1365-2443.2008.01187.x

    Valm

    ,

    A.M.

    ,

    S.

    Cohen

    ,

    W.R.

    Legant

    ,

    J.

    Melunis

    ,

    U.

    Hershberg

    ,

    E.

    Wait

    ,

    А.

Рубрики

Leave a Comment

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *