3 ферментативный анализ d-глюкозы и (

Ферментативный анализ обычно используется для количественного определения d-глюкозы в образцах микробных культур [2, 3], а также может использоваться в автоматизированной поточной установке [33]. Однако есть и ярко выраженные недостатки: во-первых, они требуют предварительного отделения бактериальных клеток, часто с помощью центрифугирования или фильтрации. Это усложняет рабочий процесс, отнимает больше времени и требует сложной платформы для работы с жидкостями. Напротив, анализ сенсора d-глюкозы требует только этапов разбавления, которые можно быстро выполнить с помощью стандартных операций с жидкостями. Во-вторых, ферментативные анализы включают этапы инкубации от 10 минут [34] до 30 минут [2]. Хотя этот трудоемкий шаг не вызывает проблем при параллельной обработке большого количества образцов, он ограничивает интервал измерений в режиме реального времени. Например, предыдущее исследование продемонстрировало измерения d-глюкозы в режиме реального времени с помощью ферментативного анализа с интервалом 80 минут [33].Биосенсор Glu ^[-] , с другой стороны, немедленно реагирует на d-глюкозу в окружающей среде, а также в присутствии клеток, что открывает путь к очень коротким циклам измерений и, таким образом, увеличивает плотность данных.

Насколько нам известно, в настоящее время не существует установленного метода ВЭЖХ на линии для микробиореакторов из-за длительного времени удерживания и иногда сложной подготовки проб [35]. В то время как подготовка проб путем фильтрации может быть легко автоматизирована, недостаток измерения только одной пробы за раз серьезно затрудняет применение методов ВЭЖХ на линии при культивировании в микробиореакторе, которое часто включает несколько параллельных культиваций.Однако преимущества хроматографических методов заключаются в измерении нескольких аналитов за один цикл.

Иммобилизация

После успешной настройки протокола оперативных измерений в среде CGXII мы направились к приложению для онлайн-измерений. Как показано выше, растворимый датчик Glu ^[-] не обладает долговременной стабильностью при температурах выше 25 °C и подвержен механическому воздействию. Нельзя избежать механического стресса, так как перемешивание необходимо для любого микробного культивирования, чтобы обеспечить достаточное перемешивание и, в случае аэробного культивирования, перенос кислорода.Таким образом, стабильность датчика должна быть улучшена. Первоначальные исследования иммобилизации с помощью His-метки не увенчались успехом, поскольку Co ²⁺ -хелатная связь с гранулами диоксида кремния, функционализированными нитрилотриуксусной кислотой (Dynabeads, ThermoScientific), не была стабильной в условиях процесса (данные не показаны). Альтернативным подходом является иммобилизация с помощью HaloTag ^® [21], который обеспечивает ковалентную иммобилизацию и очистку в одну стадию, начиная также непосредственно с неочищенных клеточных экстрактов, как это было недавно успешно продемонстрировано для иммобилизации различных ферментов [22, 36, 37]. ].

Слияние HaloTag ^® с С-концом сенсора d-глюкозы привело к сенсору Glu ^[+Halo] . Это слияние уменьшило общий коэффициент FRET, а также ΔR в растворе с 75% до почти 40% по сравнению с датчиком Glu ^[-] . Однако после иммобилизации датчик Glu ^[+Halo] восстанавливает функциональность и высокую интенсивность сигнала (ΔR 74%) датчика Glu ^[-] (подробнее см. Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Этот неожиданный результат можно объяснить следующим образом: как мы показали ранее, эффективность FRET (интенсивность сигнала) сильно зависит от расстояния и гибкости донорского FP mTurquoise2 по отношению к центральному белку, связывающему глюкозу (MglB) [20]. Из-за сходного размера FP и HaloTag ^® (около 30 кДа) нельзя исключить отрицательные стерические эффекты С-концевого HaloTag ^® в составе растворимого сенсора, что могло бы объяснить снижение общей эффективности переноса, как показано в спектрах излучения (рис. 4). Здесь снижение эффективности переноса отражается в снижении эмиссии акцепторной Венеры после возбуждения донора mTurquoise2 (λ _ex  = 425 ± 9 нм). Поскольку HaloTag ^® расположен на С-конце сенсора, белок, вероятно, деформирован, тем самым изменяя расстояние и/или ориентацию между донором и акцептором.Иммобилизация на поверхности гранул Sepharose ^® предположительно уменьшает взаимодействие HaloTag ^® с FRET-партнерами, что приводит к восстановлению функциональности. Примечательно, что на сродство (K _d ) сенсора не влияет ни добавление метки, ни иммобилизация. В растворимой форме, а также в иммобилизованной форме аффинность оставалась в том же диапазоне (0,8 мМ ± 0,2 мМ), что свидетельствует о том, что HaloTag ^® не влияет на сайт связывания d-глюкозы (дополнительный файл 1: рисунок С1).

Спектры излучения датчика Glu ^[+Halo] ( a ), не иммобилизованного и ( b ), иммобилизованного на смоле HaloLink ^® . Спектры были получены после возбуждения FRET-донора mTurquoise2 при λ _ex  = 425 нм (± 9 нм) в присутствии (черная кривая) и в отсутствие (серая кривая) 1 M d-глюкозы. Интенсивность нормализована к излучению на длине волны 485 нм (λ _em мБирюзовый2)

По сравнению с другими методами иммобилизации для таких датчиков, такими как инкапсуляция, ориентированная на сайт иммобилизация с помощью HaloTag ^® превосходит ни гибкость, ни отрицательно влияет на доступность иммобилизованного датчика.В предыдущем исследовании аналогичный датчик d-глюкозы на основе FRET был инкапсулирован в частицы кремнезема, что значительно снизило интенсивность FRET [38]. Кроме того, биосенсор можно иммобилизовать непосредственно из неочищенного клеточного экстракта, что позволяет избежать трудоемкой и дорогостоящей хроматографической очистки белка [39].

Онлайн-применение иммобилизованного сенсора Glu

С сенсором Glu ^[+Halo] , ковалентно иммобилизованным на поверхности шариков Sepharose ^® , устойчивость сенсора к механическим воздействиям была значительно повышена , что было необходимым условием для применения этих шариков непосредственно в микробном культивировании (дополнительный файл 1: рисунок S6).В то время как иммобилизация решает проблемы стабильности, гашение среды CGXII остается. Кроме того, увеличение концентрации C. glutamicum также приводит к увеличению фона из-за аутофлуоресценции [40]. Чтобы преодолеть это, иммобилизованный датчик Glu ^[+Halo] был протестирован в среде M9, типичной среде для культивирования Escherichia coli [32]. Несмотря на снижение ΔR до 35%, изменение коэффициента FRET заметно (см. Дополнительный файл 1: рисунок S3).Как следствие, измерения в среде М9 можно было проводить с помощью датчика непосредственно в культивируемом пространстве, что облегчает онлайн-приложение.

Результаты онлайн-применения иммобилизованного сенсора Glu ^[+Halo] во время культивирования E. coli K12 MG1655 в среде M9 показаны на рис. 5. На протяжении всего культивирования контролировались оба флуоресцентных сигнала сенсора. с помощью BioLector ^® и рассчитывали отношение FRET (I _A /I _D ).Затем была рассчитана внеклеточная концентрация d-глюкозы на основе отношения FRET и калибровки иммобилизованного датчика Glu ^[+Halo] в той же среде в той же цветочной пластине (см. дополнительный файл 1: рисунок S9 для калибровки). . За потреблением d-глюкозы можно было следить на протяжении всего эксперимента по культивированию (20 ч). Здесь датчик Glu ^[+Halo] имел диапазон обнаружения от 0,02 до 2 мМ (0,0036 и 0,36 г л ^-1 ). В соответствии с этим диапазоном, при истощении запасов d-глюкозы (через 18 ч) дальнейшее изменение FRET-сигнала обнаружить не удалось.Несмотря на то, что в среде не осталось d-глюкозы, биомасса продолжала увеличиваться, предположительно в результате избыточного метаболизма [41].

Соотношение FRET ( a ), истощение запасов глюкозы ( b ) и рост биомассы ( c ) при культивировании E. coli в среде M9, измеренные с помощью иммобилизованного биосенсора на основе FRET на смоле HaloLink ^® . Соотношение FRET использовалось для расчета текущей концентрации d-глюкозы на основе калибровки иммобилизованного датчика (см. дополнительный файл 1: рисунок S9)

Преимущество онлайн-измерения совпадает с недостатком, заключающимся в том, что оно ограничено определенным окном измерения, определяемым динамическим диапазоном датчика.В отличие от непрерывных измерений, где конечная концентрация d-глюкозы в образцах может быть адаптирована к аффинности сенсора, для онлайн-измерений требуются либо сенсоры с более широким динамическим диапазоном, либо другие сенсоры с соответствующей аффинностью, чтобы охватить более широкий диапазон концентраций целевого метаболита. . Аффинность сенсора d-глюкозы можно регулировать либо соответствующей аминокислотной заменой в глюкозосвязывающих белках [24, 42, 43], выбором альтернативных глюкозосвязывающих белков с более низкой аффинностью [44, 45], либо вставкой линкера последовательности [9, 20]. Поскольку до сих пор не известно ни одного датчика на основе FRET с очень широким диапазоном обнаружения [7], для расширения диапазона обнаружения можно было бы рассмотреть комбинацию нескольких датчиков d-глюкозы с разным сродством и FRET-пар, иммобилизованных на одном носителе.

Рационометрический зонд FRET, основанный на активности, выявляет вызванные онкогенами изменения в лабильных пулах меди, вызванные измененным метаболизмом глутатиона

Медь является необходимым окислительно-восстановительным питательным веществом для жизни (1), выступая в качестве мощного каталитического и/или структурного кофактора в белках для фундаментальных процессов, таких как транспорт кислорода, дыхание и метаболизм, рост и дифференцировка клеток, а также передача сигналов (2⇓⇓⇓–6).В дополнение к прочно связанным пулам меди, скрытым в активных центрах металлопротеинов, новые данные свидетельствуют о наличии лабильных пулов меди, которые относительно слабо связаны с низкомолекулярными лигандами (7). Лабильные пулы меди способствуют увеличению числа динамических сигнальных путей переходных металлов (8), включая нервную коммуникацию (9⇓–11), обоняние (12, 13), липолиз (6), циклы покоя-активности (14) и киназные пути. участвует в передаче сигнала и онкогенезе (5, 15). Действительно, нарушение регуляции меди может привести к аберрантным событиям окислительного и нитрозативного стресса, которые сопровождают заболевания, охватывающие рак (5, 16), сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (3, 17), диабет и ожирение, а также генетические болезни Менкеса и Вильсона. расстройства (18⇓⇓–21).

Дихотомия меди сигнал/стресс мотивирует разработку новых химических инструментов, помогающих расшифровать более широкий вклад меди в физиологию и патологию. В этом контексте флуоресцентные (6, 10, 11, 14, 22⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓–38), биолюминесцентные (39) и магнитно-резонансные томографы (40⇓–42) для визуализации лабильных пулов меди со специфичностью к металлу и степени окисления, особенно при использовании совместно с дополнительными методами измерения общего содержания металлов (22, 43, 44), включая масс-спектрометрию с индуктивно-связанной плазмой с лазерной абляцией (LA-ICP-MS) (45 ⇓–47), наномасштабная масс-спектрометрия вторичных ионов (38, 48) и рентгеновская флуоресцентная микроскопия (10, 49, 50) могут дать целостную картину гомеостаза металлов для данной биологической модели. В соответствии с этим химическим ограничением при разработке флуоресцентных зондов является то, что подавляющее большинство индикаторов меди на сегодняшний день реагируют только изменением интенсивности флуоресценции одного цвета, что может усложнить количественные измерения пулов меди и/или сравнение уровней меди в разных средах. биологических образцов из-за потенциальных изменений в поглощении зонда наряду с помехами, возникающими из-за независимых от меди явлений, таких как неоднородность толщины образца и интенсивности света (51, 52).Чтобы решить эту проблему, логометрические датчики, использующие спектральные изменения возбуждения/излучения на двух или более длинах волн, в принципе могут обеспечивать внутреннюю самокалибровку для неоднородной нагрузки датчика и ограничивать интерференцию между различными образцами (53⇓⇓⇓–57). Однако большинство ратиометрических флуоресцентных индикаторов меди, о которых сообщалось на сегодняшний день, в значительной степени ограничены отсутствием специфичности к степени окисления и/или снижением общей интенсивности флуоресценции при обнаружении меди (31⇓⇓⇓⇓⇓–37).

Теперь мы представляем разработку, синтез и биологическое применение логометрического флуоресцентного медного индикатора первого поколения, флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) медного зонда-1 (FCP-1).Этот сенсорный зонд, основанный на активности, использует хемоселективное Cu(I)-зависимое окислительное C-O расщепление трис[(2-пиридил)метил]аминовой (ТРА) единицы (28, 58, 59), связывающей донорную флуоресцеиновую и акцепторную единицы родамина. (Схема 1). Высокая специфичность FCP-1 к металлам и степени окисления для Cu(I), наряду с его двухцветным ратиометрическим ответом FRET, позволяет использовать его для мониторинга динамических изменений в лабильных пулах Cu(I) в живых клетках. Благодаря самокалибровке, обеспечиваемой его логометрическим ответом, FCP-1 был способен надежно обнаруживать снижение эндогенных уровней лабильного Cu(I) в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), лишенных высокоаффинного переносчика меди Ctr1 ( Ctr1 ^-/- ) относительно конгенеров дикого типа. Дальнейшие эксперименты выявили колебания лабильных уровней Cu(I), но не общего уровня меди, при окислительно-восстановительном стрессе, вызванном генетическими изменениями в путях биосинтеза глутатиона. Интересно, что дефицит лабильных пулов Cu(I) был обнаружен при введении онкогенных BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , связывая лабильную дисрегуляцию меди с онкоген-зависимым окислительно-восстановительным статусом. Способность FCP-1 отслеживать лабильные пулы Cu(I) с помощью логометрического ответа обеспечивает отправную точку для дальнейших исследований окислительно-восстановительного вклада в передачу сигналов переходных металлов.

Результаты и обсуждение

Дизайн, синтез и характеристика FCP-1.

Вдохновленный бионеорганическими модельными соединениями TPA, которые демонстрируют Cu(I)-зависимую химию окислительного расщепления (28, 58, 59), наша конструкция FCP-1 на схеме 1 соединяет донор флуоресцеина FRET и акцептор родамина FRET с чувствительным к меди TPA компоновщик. Изменения в лабильных уровнях Cu(I) будут модулировать внутримолекулярную эффективность FRET и приводить к различным интенсивностям флуоресценции донора и акцептора на 2 разных длинах волн, которые могут быть откалиброваны логометрическим способом.При более низких уровнях Cu(I) зонд остается интактным с более высоким FRET и излучением с преобладанием родамина, при этом более высокие уровни Cu(I) приводят к зависимому от меди окислительному расщеплению линкера TPA и более низкому FRET и эмиссии с преобладанием флуоресцеина.

Синтез FCP-1 начинается с получения метилового эфира флуоресцеина, функционализированного 2-бромметилпиридином ( 2 ), и родамина, функционализированного пиколиламинами ( 5 ; схема 2). Соединение 2 было синтезировано в 2 стадии из ранее описанного метилового эфира флуоресцеина путем нуклеофильного замещения на 6-(бромметил)-2-пиридинметанол и последующего бромирования метилового спирта.Параллельно был получен нозил-защищенный пиколиламин ( 3 ) путем монозамещения бис(хлорметил)пиридина из 4-нитро- N -(2-пиридинилметил)бензолсульфонамида, а затем проведена реакция с пиперазинил-функционализированным родамином (Pz-родамином). позволить себе 4 . Затем с нозильной группы 4 снимают защиту тиофенолом и K ₂ CO ₃ с получением 5 . Имея в руках ключевые фрагменты 2 и 5 , мотив TPA может быть получен путем нуклеофильного замещения 2-бромметильной группы на 2 на пиколиламин на 5 в основных условиях, что дает окончательный логометрический зонд FCP-1. который был охарактеризован с помощью ЯМР ¹ H и ¹³ C{ ¹ H}, МС высокого разрешения и МС с использованием жидкостной хроматографии (ЖХ-МС; SI Приложение , рис.С1). Зонд Cu(I) на основе интенсивности FL-TPA был приготовлен в качестве контрольного соединения с тем же триггером чувствительности на основе Cu(I)-зависимой активности и каркасом флуоресцеина, но без логометрического ответа (схема 2).

Синтез ФЦП-1 и контрольного зонда ФЛ-ТПА.

Реакционная способность и селективность FCP-1 по отношению к меди.

Известно, что внутриклеточная среда восстанавливается и содержит высокие концентрации биомолекул, что приводит к скоплению макромолекул (60, 61).Таким образом, чтобы имитировать аспекты этих свойств in vitro, мы оценили FCP-1 в буфере PBS, содержащем глутатион (2 мМ) и полиэтиленгликоль (ПЭГ)-400 (40%, об./об.). FCP-1 показал максимумы поглощения при 465, 493 и 552 нм с молярными коэффициентами экстинкции 20 000, 22 100 и 40 000 M ^-1 см ^-1 соответственно ( SI Приложение , рис. S2). Первые 2 максимума поглощения соответствовали поглощению флуоресцеинового фрагмента, так как аналогичные максимумы поглощения при 460 и 489 нм были обнаружены в спектрах поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S2) и сообщается о метиловом эфире флуоресцеина в моноклетке (62, 63), тогда как наименьшее поглощение энергии при 552 нм связано с родамином ( SI Приложение , рис. S2). Было обнаружено, что при фотовозбуждении при 458 нм FCP-1 излучает при 526 и 576 нм (рис. 1—), что соответствует сигнатурам флуоресцеина и родамина соответственно. Примечательно, что строительный блок Pz-родамина демонстрирует лишь слабое поглощение при 458 нм ( SI, Приложение , рис. S2). Вместе со значительным вкладом низкоэнергетической флуоресценции от возбуждения от 450 до 500 нм, который находится в области поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S3), данные подтверждают возникновение FRET от донора флуоресцеина к акцептору родамина. При использовании FL-TPA в качестве эталонного донорного соединения FRET ( SI, Приложение , рис. S4) с предположением, что тушение донорной флуоресценции происходит только в результате процесса FRET, эффективность FRET в кассете FCP-1 оценивается в 84%. .

Фотофизические свойства и селективность Cu(I) FCP-1 в водных буферных растворах. ( A ) Изменения в скорректированных спектрах излучения FCP-1 (5 мкМ) в водном буферном растворе.( Врезка ) Изменения логометрической эмиссии FCP-1, F ₅₂₆ / F ₅₇₆ с Cu(I) (10 мкМ) с течением времени. ( B ) Скорректированные спектры излучения FCP-1, измеренные при различных концентрациях. ( C ) Существенных изменений коэффициента выбросов F ₅₂₆ / F ₅₇₆ при различных концентрациях FCP-1 не наблюдается. ( D ) Изменение F ₅₂₆ / F ₅₇₆ отношения FCP-1 (5 мкМ) к различным биологически значимым ионам металлов, а также кобальт(II)-содержащему витамину B ₁₂ .Черные столбцы представляют логометрическую эмиссионную реакцию, наблюдаемую при добавлении конкурирующих ионов металлов (1 мМ для Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ и Ca ²⁺ и 10 мкМ для всех других d- блокировать ионы металлов, а также витамин B ₁₂ ) через 15 мин. Красные столбцы представляют собой логометрический отклик эмиссии при последующем добавлении 10 мкМ Cu(I) через 15 мин. Легенда: 1, Na ⁺ ; 2, К ⁺ ; 3, Мг ²⁺ ; 4, Са ²⁺ ; 5, Мп ²⁺ ; 6, Fe ²⁺ ; 7, 10 мкМ Co ²⁺ ; 8, 1 мкМ Co ²⁺ ; 9, витамин В ₁₂ ; 10, Ni ²⁺ ; 11, Cu ⁺ ; 12, Zn ²⁺ . ( E ) Спектры эмиссии и ( F ) F ₅₂₆ / F ₅₇₆ коэффициент эмиссии (черный) FCP-1 (5 мкМ) или FCP-1 с добавлением (красный) Cu (II) (10 мкМ), (синий) Cu(II) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) или (голубой) Cu(I) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) через 15 мин. Все спектры были получены в водном буфере (PBS с 2 мМ GSH и 40 об.% ПЭГ-400) с λ _ex = 458 нм.

После добавления Cu(I) FCP-1 показал увеличение эмиссии флуоресцеина при 526 нм с сопутствующим снижением флуоресценции родамина при 576 нм (рис.1 А ). Анализ ЖХ-МС подтверждает образование фрагментов метилового эфира флуоресцеина ( P1 ) и родамин-ТРА ( P2 ) при добавлении Cu(I) к раствору FCP-1 ( SI Приложение , рис. S5) и аэробные условия необходимы для инициирования спектральных изменений излучения ( SI Приложение , рис. S6), что соответствует Cu(I)-опосредованному окислительному расщеплению связи C-O бензилового эфира на линкере TPA FCP-1. Это расщепление С-О приводит к отделению донора флуоресцеина от акцептора родамина и, следовательно, к снижению внутримолекулярной эффективности FRET с логометрическим изменением спектра излучения (рис.1 А ). Рационометрическое изменение флуоресценции FCP-1 при 526 и 576 нм ( F ₅₂₆ / F ₅₇₆ ) было быстрым и достигло насыщения после приблизительно . 30 мин в присутствии двукратного избытка Cu(I) (10 мкМ). Примечательно, что соотношение F ₅₂₆ / F ₅₇₆ FCP-1 показало линейную зависимость доза-реакция при добавлении Cu(I) от 0,01 до 1 мкМ ( SI Приложение , рис. S7 A ), подчеркивая способность FCP-1 обнаруживать уровни Cu(I) в этом диапазоне по логометрическому изменению флуоресценции.FCP-1 показал высокую чувствительность к Cu(I), о чем свидетельствуют заметные изменения спектра излучения при 10 нМ Cu(I) ( SI Приложение , рис. S7 B ) и предел обнаружения 16,7 нМ на основе метод 3σ из 5 независимых экспериментов (64, 65). Что еще более интересно, базальный коэффициент эмиссии FCP-1 F ₅₂₆ / F ₅₇₆ не показал существенных изменений при различных концентрациях зонда (от 0,5 до 20 мкМ; рис. 1 B и C ). .Эта внутренняя самокалибровка является преимуществом, так как было обнаружено, что FCP-1 менее флуоресцирует при более высоких концентрациях, предположительно, из-за самогашения, которое часто встречается у флуорофоров ( SI Приложение , рис. S8) (66). . Действительно, незначительные изменения в логометрической эмиссии FCP-1 указывали на то, что FRET происходил в основном по внутримолекулярному механизму, а независимая от концентрации логометрическая флуоресценция FCP-1 еще больше подчеркивает его потенциал в сравнительной визуализации лабильных пулов Cu(I) в биологических образцах с помощью избежание возможных осложнений, возникающих из-за различий в поглощении зонда, толщине образца и интенсивности света.

Рационометрическое изменение флуоресценции FCP-1 было селективным по отношению к Cu(I) по сравнению с другими биологически значимыми ионами металлов, за исключением свободного Co(II) в концентрации 10 мкМ, который незначительно изменил флуоресценцию FCP-1 (рис. 1 D ). Примечательно, что эта концентрация экзогенного Co (II) намного выше, чем физиологически значимые уровни лабильного Co (II), поскольку известно, что этот ион металла прочно связан с белками. Действительно, FCP-1 не показал существенных изменений в логометрическом сигнале в присутствии 10 мкМ кобаламина (витамин B ₁₂ ) (67), который является преобладающей формой Co(II) в системах млекопитающих, предполагая, что вмешательство в обнаружение Cu(I) по FCP-1 из Co(II) в биологических образцах должно быть пренебрежимо мало.Конкурентные эксперименты также показали способность FCP-1 обнаруживать Cu(I) в растворах, содержащих другие биологически значимые ионы металлов (рис. 1 D ). Помимо селективности по металлам, логометрический отклик FCP-1 зависит от степени окисления Cu(I), поскольку зонд не реагирует логометрически на Cu(II) (рис. 1 E и F ). В подтверждение этой селективности по степени окисления совместная инкубация FCP-1 с Cu(II) и избытком глутатиона, который легко восстанавливает Cu(II) до Cu(I), привела к эмиссионным спектрам и F ₅₂₆ F ₅₇₆ , которое идентично полученному при обработке FCP-1 Cu(I) и избытком глутатиона (рис. 1 E и F ). Эта специфичность степени окисления важна для применения FCP-1 для визуализации динамических изменений во внутриклеточных лабильных пулах Cu(I) при окислительно-восстановительном стрессе и онкогенной трансформации, которые мы опишем позже.

Наконец, FCP-1 не реагирует на Ag(I), который является близким аналогом Cu(I), но не обладает мощной кислородозависимой окислительно-восстановительной активностью ( SI Приложение , рис. S9). Ввиду низкой растворимости Ag(I) в присутствии ионов хлора и других галогенидов, буферный раствор NaH ₂ PO ₄ (50 мМ, pH 7.4) использовали вместо раствора PBS в этих сериях экспериментов. Действительно, в присутствии Ag(I) не наблюдалось существенного изменения отношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ , в то время как Cu(I) индуцировало патентное увеличение F ₅₂₆ / F ₅₇₆ соотношение FCP-1 в том же буферном растворе ( Приложение SI , рис. S9). Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемые логометрические изменения флуоресценции FCP-1 при добавлении Cu(I) объясняются окислительно-восстановительной активностью Cu(I).Кроме того, было обнаружено, что присутствие восстанавливающих агентов имеет решающее значение для запуска опосредованных Cu(I) логометрических изменений флуоресценции FCP-1 ( SI, Приложение , рис. S10), и действительно аналогичные изменения флуоресценции также наблюдались при использовании аскорбата. вместо 2 мМ глутатиона (GSH) в качестве восстановителя ( SI Приложение , рис. S11). Наряду с наблюдаемым увеличением уровней GSSG (окисленная форма GSH) с сопутствующим падением уровней GSH (восстановленная форма) при добавлении Cu(I) к раствору смеси FCP-1 и GSH ( SI Приложение , Инжир.S5 A ), эти данные подтверждают роль восстанавливающих агентов в «рециркуляции» окислительно-восстановительных соединений Cu(I) для связывания с рецептором TPA и запуска последующего основанного на активности расщепления связи C-O бензилового эфира на компоновщик. Этот разрыв связи происходит главным образом по окислительному механизму, поскольку при добавлении Cu(I) в анаэробных условиях не наблюдается значительных спектральных изменений излучения ( SI Приложение , рис. S6). Получение фрагментов метилового эфира флуоресцеина и родамина-ТРА ( SI Приложение , рис.S5) приводит к снижению внутримолекулярной эффективности FRET и увеличению отношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ .

FCP-1 может отображать лабильные пулы Cu(I) в живых клетках.

Учитывая селективный и чувствительный ответ FCP-1 на металлы и степени окисления на Cu(I), мы попытались применить этот зонд для логометрической флуоресцентной визуализации лабильных пулов Cu(I) в живых клетках. С этой целью клетки HEK 293T подвергали воздействию различных доз CuCl ₂ (от 25 до 300 мкМ), тщательно промывали для удаления избытка меди из среды, а затем инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в течение 45 мин и визуализировали. .Клетки с добавлением меди показали статистически значимое дозозависимое увеличение отношения F _{зеленый} / F _{оранжевый} по сравнению с контрольными клетками-носителем (фиг. 2 B ). Напротив, клетки HEK 293T с дефицитом меди, полученные обработкой непроницаемым для мембран хелатором меди, батокупроинсульфонатом (BCS; 100 мкМ), промытыми и впоследствии инкубированными с FCP-1 (5 мкМ), показали статистически значимое снижение F. _{зеленый} / F _{оранжевый} соотношение по сравнению с контрольными клетками (рис.2 C и D ). Наблюдаемое увеличение и снижение лабильных уровней Cu(I) при добавлении меди (CuCl ₂ ) и лечении истощением меди (BCS) соответственно, измеренное с помощью визуализации FCP-1, было подтверждено дополнительными измерениями ICP-MS общих уровней меди. показывая ожидаемое увеличение и уменьшение общего пула меди (рис. 2 E ). Контрольные эксперименты показали, что клетки оставались жизнеспособными, на что указывало окрашивание ядер ( Приложение SI , рис.С12 и С13). Эти данные показывают, что FCP-1 способен визуализировать как увеличение, так и уменьшение лабильных пулов Cu(I) в живых клетках с помощью ратиометрического считывания флуоресценции.

Для дальнейшего подтверждения способности FCP-1 отслеживать дифференциальные уровни лабильного Cu(I) в клетках, Ctr1 ^+/+ MEF, инкубированные с различными концентрациями CuCl ₂ , показали дозозависимое увеличение в соотношении FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} . Напротив, статистически значимых изменений в соотношениях F _{зеленый} / F _{оранжевый} не наблюдалось в Ctr1 ^-/- МЭФ, инкубированных с FcCl 7 2 Инжир.3 A и B ). Тем временем жизнеспособность клеток сохранялась, что было подтверждено окрашиванием ядер DRAQ5 ( SI, Приложение , рис. S14 и S15). Разница логометрического флуоресцентного ответа FCP-1 на экзогенную добавку меди между MEF дикого типа и MEF с нокаутом Ctr1 согласуется с неэффективным поглощением меди, а не с изменениями в оттоке меди при лечении Ctr1 ^-/- МЭФ с мембранонепроницаемым хелатором меди БКС приводили к снижению соотношения F _{зеленый} / F _{оранжевый} , подобно тому, что наблюдается в Ctr1 ^+/+ МЭФ (рис.3 A и B ). Дополнительные измерения ICP-MS подтверждают, что общие базальные уровни меди в Ctr1 ^−/− MEF ниже, чем Ctr1 ^+/+ MEF ( SI, Приложение ). Важно отметить, что логометрический ответ FCP-1 является ключом к его способности различать базальные и пониженные уровни лабильного Cu(I). Действительно, контрольный зонд FL-TPA, который демонстрирует флуоресцентный ответ «включения» без логометрической самокалибровки, не смог различить различия в базальных лабильных уровнях Cu(I) в Ctr1 ^+/+ MEF. и Ctr1 ^−/− MEF (рис.3 C и D ), при этом обнаруживая изменения в лабильной меди при добавлении экзогенной меди ( SI Приложение , рис. S17). Этот результат можно объяснить потенциальными различиями в загрузке зонда в 2 клеточные линии MEF, что еще больше подчеркивает самокалибрующийся характер логометрического зонда FCP-1 как критической функции для точного определения уровней аналита в различных биологических образцах. Наконец, мы проверили, может ли FCP-1 разрушить лабильные пулы меди, измерив уровни белка CCS в MEF, обработанных FCP-1 или BCS, последний в качестве положительного контроля для снижения содержания меди в клетках и повышения стабильности белка CCS. Действительно, уровни белка CCS не изменились в клетках, обработанных концентрацией FCP-1, достаточной для визуализации клеточных лабильных пулов меди, в то время как обработка BCS увеличивала CCS, как и ожидалось ( SI, Приложение , рис. S18), подтверждая, что FCP-1, сам по себе не изменяет клеточные уровни меди в этих условиях. Данные демонстрируют, что FCP-1 может контролировать базальные уровни эндогенного лабильного Cu(I) и истощение таких пулов в ответ на снижение поглощения меди клетками с помощью генетических или фармакологических средств.

FCP-1 Идентифицирует динамическое изменение лабильного Cu(I) по сравнению с общими пулами меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе.

Принимая во внимание специфичность состояния окисления FCP-1 по отношению к Cu(I), мы исследовали влияние клеточного окислительно-восстановительного статуса на лабильные пулы Cu(I), которое остается недостаточно изученным. Во-первых, мы подтвердили способность FCP-1 обнаруживать изменения в лабильных уровнях Cu(I) в клетках HeLa при обработке CuCl ₂ и BCS (рис. 4 A ). Затем мы отслеживали эффект добавления аскорбата, который является мощным восстановителем, на внутриклеточные лабильные пулы Cu(I).Интересно, что мы наблюдали статистически значимое увеличение соотношения FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} , что свидетельствует об увеличении уровней лабильного Cu(I) в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 В ) (31). Поскольку сопутствующие измерения ICP-MS не показали изменений общего уровня меди в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными носителями (рис. 4 C ), увеличение F _{зеленого} / F _{оранжевого} может быть объясняется повышением уровня лабильного Cu(I).Несколько потенциальных факторов могут способствовать этому наблюдению в ответ на этот экзогенный восстанавливающий агент, включая сдвиг в глобальном или локальном окислительно-восстановительном балансе Cu(I)/Cu(II), пониженную клеточную или субклеточную способность буферировать Cu(I) и /или релокализация/рекомпарментализация лабильных пулов Cu(I).

FCP-1 идентифицирует изменения лабильного Cu(I), но не общего содержания меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе. Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa, предварительно обработанных ( A ) контролем растворителя, CuCl ₂ (200 или 300 мкМ) или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 ч или ( B ) контролем растворителя, аскорбатом (1 мМ) или BSO (1 мМ) в полной среде в течение 4 часов.Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин и визуализировали с λ _ex = 458 нм. На гистограммах показана средняя клеточная логометрическая эмиссия FCP-1, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , определенная из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Общие клеточные уровни ⁶³ Cu определяли с помощью экспериментов ICP-MS (с нормализацией различных количеств клеток по общему клеточному уровню ³¹ P). Столбики погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 и **** P < 0,0001 и не показывают никаких изменений ни при обработке аскорбатом, ни при обработке BSO.

Получив эти результаты, мы затем попытались использовать FCP-1 для изучения потенциальных связей между поддержанием лабильных пулов Cu(I) и эндогенными центральными окислительно-восстановительными медиаторами в клетке. В этом контексте глутатион (GSH) является вездесущим природным антиоксидантом и ключевой малой молекулой для поддержания надлежащего окислительно-восстановительного статуса клетки (71).Определяющая скорость стадия биосинтеза GSH включает глутаматцистеинлигазу (GCL), которая может ингибироваться бутионинсульфоксимином (BSO) (72). Интересно, что мы наблюдали, что соотношение FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} было выше в обработанных BSO клетках HeLa по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 B ), что указывает на увеличение лабильных Уровни Cu(I) при блокировке синтеза GSH. Более того, общие внутриклеточные уровни меди существенно не отличались между клетками, предварительно обработанными BSO, и контрольными клетками, как показано с помощью ICP-MS (фиг.4 C ), показывая, что динамические изменения происходят в лабильном пуле Cu(I), а не в общем увеличении или уменьшении общего пула меди. В целом, мы предостерегаем от чрезмерной интерпретации этих данных как подтверждающих простую и прямую модель комплексообразования Cu(I)-глутатион, хотя было обнаружено, что водные растворы FCP-1 и Cu(I) показывают более высокие значения F ₅₂₆ / Соотношения F ₅₇₆ при более низких концентрациях GSH in vitro ( SI Приложение , рис. S19), переменные значения константы диссоциации и стехиометрии медь-лиганд, полученные в различных буферных условиях, предполагают более сложное взаимодействие между путями металлического и окислительно-восстановительного гомеостаза (7 , 22, 73). Действительно, GSH является не только восстанавливающим агентом, но также сообщается, что он взаимодействует с металлошаперонами, такими как ATOX1, или металл-буферными/поглощающими белками, такими как металлотионеин, с образованием комплексов, которые могут прочно связывать медь (73⇓⇓–76). Следовательно, наблюдаемое увеличение лабильных уровней Cu(I) в результате дефицита GSH может действовать через более сложные косвенные механизмы, что требует дальнейшего изучения.

Для дальнейшего изучения корреляции между лабильным пулом Cu(I) и измененным метаболизмом GSH мы подготовили 2 клеточные линии MEF для исследования, где одна линия демонстрирует более низкие уровни общего GSH за счет стабильного генетического нокдауна эндогенного Gclc (каталитическая субъединица фермент, ограничивающий скорость GCL в синтезе GSH), а другая линия демонстрирует более низкие уровни GSH и более низкое соотношение восстановленного и окисленного GSH (GSH/GSSG) посредством нокдауна глутатионредуктазы ( Gsr ; НАДФН-зависимый фермент, расщепляющий дисульфидная связь на 2 окисленных молекулах GSH) (71, 77). Как и ожидалось, нокдаун эндогенного Gclc , опосредованный короткой шпилечной РНК (кшРНК) (рис. 5 A и B ), значительно снижал общий уровень GSH до степени, аналогичной MEF, обработанным BSO, который сильно ингибирует ферментативную функцию GCLC. , по сравнению с нецелевым скрембл-контролем ( Scr ) MEF (рис. 5 C ). Важно отметить, что в этих клетках с нокдауном Gclc не наблюдается значительного изменения соотношения GSH/GSSG, несмотря на более низкие уровни общего GSH (рис.5 Д ). Напротив, генетический нокдаун Gsr с помощью кшРНК значительно снизил как общий уровень GSH, так и соотношение GSH/GSSG, в то время как обработка ингибитором GSR кармустином (бис-хлорэтилнитрозомочевина, BCNU) лишь значительно снизила соотношение GSH/GSSH (рис. 5). C–F ), что указывает на колебания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса в сторону более окислительной среды при отсутствии способности регенерировать GSH из GSSG.

FCP-1 показывает увеличение или истощение лабильных пулов Cu(I), вызванное генетическими изменениями общего глутатиона (GSH) или соотношения восстановленного/окисленного глутатиона (GSH/GSSG).( A ) Нормализованная экспрессия qPCR Gclc мРНК и ( B ) иммуноблот-детекция GCLC или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих нецелевую контрольную кшРНК ( Scr ) и Gclc кшРНК. ( C и D ) Количественное определение общего клеточного глутатиона (GSH, микромолярный) или отношения GSH к GSSG (GSH/GSSG) ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA, Gsr shRNA , или Scr , обработанный 1 мМ BSO, или 0.1 мМ BCNU. Уровни GSH и GSH/GSSG определяли с использованием набора для анализа GSH/GSSG-Glo, а результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11). ( E ) экспрессия qPCR Gsr мРНК и ( F ) иммуноблот-детекция GSR или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr и Gsr shRNA. ( G ) Репрезентативные конфокальные флуоресцентные изображения MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA, инкубированные FCP-1.( H ) Количественное определение нормализованной средней флуоресценции FCP-1 ( F _{зеленый} / F _{оранжевый} ) ± SEM. Данные взяты из анализа 98 отдельных клеток. ( I ) Предлагаемая модель изменений ферментов биосинтеза глутатиона и окислительно-восстановительного стресса на биодоступность лабильных пулов Cu(I). ( J ) Общие уровни Cu (частей на миллион, ppm), определенные с помощью ICP-MS в MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA на массу образца ± стандартная ошибка среднего ( n = 6) .Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. * P < 0,05, ** P < 0,01 и **** P < 0,0001; нс, статистически незначимо.

После подтверждения успешного манипулирования либо уровнями GSH, либо соотношением GSH/GSSG FCP-1 применяли для исследования относительных уровней лабильного Cu(I) в этой панели генетически определенных клеточных линий. Клетки с нокдауном Gclc показали более высокое соотношение FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} по сравнению с клетками Scr , в то время как более низкое значение FCP-1 F

/ _{зеленый} Соотношение _{оранжевый} наблюдали в клетках с нокдауном Gsr по сравнению с контролем (фиг.5 G и H ). Поскольку нокдаун Gclc ингибирует фермент, участвующий в определяющей скорость стадии биосинтеза GSH, и имитирует фармакологическое лечение с помощью BSO (рис. 4 B ), мы приписываем наблюдаемое увеличение F _{зеленому} / F _{. отношение оранжевого} к снижению общего уровня GSH. Минимальное изменение отношения GSH/GSSG в этой клеточной линии с нокдауном Gclc предполагает, что общее окислительно-восстановительное состояние клетки не изменяется, и вместо этого указывает на снижение уровней лабильных Cu(I)-буферных систем (рис. 5 I ). Включены потенциальные аддукты GSH-металлошаперон или GSH-металлотионин, оба из которых могут влиять на слабосвязанные пулы Cu(I) по сравнению с прочно связанными. С другой стороны, клетки с нокдауном Gsr показали более низкое отношение GSH/GSSG (рис. 5 D ), что отражает более общую окислительную внутриклеточную среду и может привести к сдвигу динамического баланса Cu(I/II). ) пулов, что приводит к снижению лабильных уровней Cu(I) (рис. 5 I ). Хотя общие уровни GSH также снижаются в клетках с нокдауном Gsr , что может в некоторой степени повышать биодоступность лабильного Cu(I), статистически значимое снижение соотношения FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} относительно контроля указывает на общий лабильный дефицит Cu(I) и предполагает, что окислительно-восстановительный вклад большего количества GSSG по сравнению с GSH является доминирующим фактором.Поскольку механизм обнаружения на основе активности FCP-1 основан на кислородозависимой окислительно-восстановительной реакции с Cu(I), мы провели дополнительную серию контрольных экспериментов с использованием ранее описанного медного флуоресцентного зонда включения, Copper Fluor-4 (CF4). , который действует по прямому обратимому механизму, основанному на связывании Cu(I) (14). CF4 показал повышенную флуоресценцию в нокаутных клеточных линиях Gclc , но снизил флуоресценцию в нокаутных клетках Gsr , что хорошо согласуется с данными, полученными с FCP-1 ( SI Приложение , рис.S20), обеспечивая дополнительную поддержку изменений в лабильных пулах Cu(I), вызванных изменениями статуса GSH и GSH/GSSG. Наконец, в то время как лабильные пулы Cu(I) изменяются в MEF без Gclc или Gsr , никаких изменений в общем содержании меди не наблюдалось при измерении с помощью ICP-MS (фиг. 5 J ). Эти эксперименты показывают, что лабильные пулы Cu(I) могут увеличиваться и/или истощаться глутатион-зависимым образом в зависимости как от общего уровня GSH, так и от окислительно-восстановительного отношения GSH/GSSG.

Онкогенные мутации BRAF

^V600E и KRAS ^G12 приводят к лабильному дефициту Cu(I), частично обусловленному снижением экспрессии GSR и сниженной способностью регенерировать GSH.

Отметив растущие связи между сигнальными путями меди и киназы, участвующими в онкогенезе, мы затем попытались применить идентификацию перекрестных помех медь-глутатион к онкогенезу. Действительно, быстрая пролиферация, связанная с онкогенезом, требует от раковых клеток увеличения энергетического метаболизма и запуска клеточных механизмов для ответа на онкогенный стресс для поддержания неограниченного роста опухоли, выживания и терапевтической резистентности.Например, многие солидные опухоли демонстрируют повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) в ответ на более высокие потребности в энергии и митохондриальную дисфункцию. В результате это вызывает антиоксидантную программу по детоксикации АФК и поддержанию более надежного окислительно-восстановительного баланса (78). Например, MEF, экспрессирующие условные онкогенные аллели KRAS ^G12D или BRAF ^V619E , демонстрируют пониженные уровни внутриклеточных АФК с сопутствующим увеличением экспрессии мРНК генов метаболизма глутатиона Gclc и Gclm (79). Более того, эктопическая экспрессия KRAS ^G12D повышала общий уровень GSH, но снижала соотношение GSH/GSSG. Однако вопрос о том, изменяют ли онкогенные мутации в BRAF или KRAS внутриклеточные пулы лабильного Cu(I) путем нарушения внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса, в частности, через глутатионовые пути, остается недостаточно изученным.

Для ответа на этот вопрос иммортализованные MEF трансформировали с помощью BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , а уровни внутриклеточного лабильного Cu(I) оценивали с помощью ратиометрической визуализации FCP-1.Интересно, что мы наблюдали снижение средней логометрической флуоресценции клеток клеток MEF, трансформированных BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , по данным FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} . контрольные конгенеры (рис. 6 A и B ). Эти результаты были фенокопированы в экспериментах по визуализации живых клеток с использованием комплементарного зонда CF4, что позволяет предположить, что слабосвязанные пулы внутриклеточного Cu(I) уменьшаются при онкогенной трансформации ( SI Приложение , рис. S21 A и B ). В соответствии с этим мы обнаружили, что стабильность белка CCS, который расщепляется Cu-зависимым образом, повышается в клетках, стабильно экспрессирующих эти онкогены, или при обработке клеток хелатором Cu BCS в качестве положительного контроля, что свидетельствует об истощении лабильных внутриклеточных Медные бассейны (рис. 6 C ). Чтобы определить, отражается ли наблюдаемый лабильный дефицит Cu(I), обнаруженный с помощью изображений FCP-1 и CF4 живых клеток, в изменениях общего уровня Cu в клетках, была проведена ICP-MS на контроле, BRAF ^V600E — или KRAS ^{. G12D} -экспрессирующие MEF, и эти клетки показали неизмененные уровни общего Cu (фиг.6 D ), подтверждая, что лабильный пул Cu(I) избирательно изменен, а не общий пул Cu. Кроме того, уровни транскриптов Ctr1 в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D остаются такими же, как и в контрольных клетках, что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение уровней лабильного Cu(I) не связано с изменениями клеточного импорта Cu (рис. 6). Е ). Хотя уровни транскриптов Atp7a были незначительно ниже как в клетках BRAF ^V600E , так и в клетках KRAS ^G12D (фиг.6 F ), эти изменения в экспрессии мРНК Atp7a могут отражать клетки, чувствительные к более низким биодоступным уровням Cu(I). В качестве альтернативной гипотезы дифференциальной экспрессии переносчиков Cu CTR1 и ATP7A для снижения лабильных уровней Cu(I) недавние исследования установили, что снижение уровней CTR1 или введение поверхностно-доступных мутаций в MEK1, который функционирует после онкогенного BRAF ^V600E , поскольку подход к нарушению связывания Cu снижал передачу сигналов, управляемую BRAF ^V600E , и рост опухоли (5, 80).Таким образом, взаимодействие Cu-MEK1/2 имеет важное значение для управляемой BRAF ^V600E передачи сигналов и онкогенеза, а снижение лабильных уровней Cu в MEF, трансформированных BRAF ^V600E , потенциально может быть вызвано повышенной доставкой Cu к MEK1/2 для поддержки гиперактивированного передача сигналов митоген-активируемой протеинкиназы. Чтобы экспериментально рассмотреть эту возможность, MEF, трансформированные BRAF ^V600E , были сконструированы для стабильной экспрессии скремблированной кшРНК или Mek1 кшРНК с РНК-опосредованным интерференционно-устойчивым MEK1 дикого типа или Cu-связывающим мутантом MEK1 (MEK1 ^CBM ). и ратиометрическую флуоресценцию FCP-1 в этих клеточных линиях сравнивали с нетрансформированными MEF.В то время как экспрессия BRAF ^V600E снижала экспрессию F _{зеленого} / F _{оранжевого} примерно на 20%, это снижение сохранялось в присутствии MEK1 дикого типа и MEK1 ^CBM , что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение лабильный пул Cu(I) не зависит от связывания MEK1/2 Cu ( SI, Приложение , рис. S22).

Рис. 6.

Онкогенный BRAF ^V600E и KRAS ^G12D приводят к уменьшению лабильных пулов Cu(I) за счет снижения уровней Gsr и увеличения экспрессии CCS. ( A ) Представитель Ratiometic Ise-Cell Визуализация FCP-1 на МЭФ, стабильно экспрессируя Nontarting Control Shrna ( SCR ), BRAF ^V600E кДНК, или KRAR ^G12D кДНК. ( B ) Количение среднего флуоресценции FCP-1 ( F _Green /9 F _Orange ) ± SEM от MEFS стабильно экспрессирует SCR , BRAF ^V600E CDNA, или Крас ^G12D кДНК.Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. Данные взяты из анализа 105 или более отдельных клеток. ( C ) Обнаружение иммуноблота CCS или актина в МЭФ в меф. Количественное определение: ΔCCS/ACTIN нормализовано до Scr . Результаты 3 независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t .( D ) Количественная оценка средних уровней Cu (детали на миллион, ч / млн), обнаруженные ICP-MS от MEFS, стабильно экспрессируют SCR , BRAF ^V600E кДНК, или KRAS ^G12D кДНК на массу образца ± стандартная ошибка среднего ( n = 5). Результаты сравнивались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. ( E и E и F и F ).( n = 4). Результаты сравнивались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета. ( G и H ) Количественное определение общего клеточного глутатиона (GSH, мкМ) или отношения GSH к GSSG (GSH/GSSG) ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^{9 cNA 9040E или кДНК KRAS G12D . Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета ( n ≥ 11).Данные взяты из 4 биологических повторов, проведенных в трех повторностях. ( I и J и J ) QPCR Выражение GSRC или GSR мРНК от МЭФС стабильно экспрессирует SCR , BRAF V600E V600E CDNA, или KRAS G12D кДНК. Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета ( n = 4). Данные взяты из 4 биологических повторов, проведенных в трех повторностях.( K ) Обнаружение иммуноблота GCLC, GSR, или актина в МЭФ, стабильно экспрессирует SCR , BRAF V600E кДНК, или KRAS G12D кДНК. Количественное определение: ΔGCLC/ACTIN или ΔGSR/ACTIN, нормализованные к Scr . Результаты 3 независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t . ( л ) проточный цитометрический анализ уровня роли, количественно, количественно, средним видимым Cellrox Зеленая флуоресцентная интенсивность ± SEM от MEFS стабильно экспрессирует SCR , BRAF V600E кДНК, или KRAS G12D кДНК.Результаты сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Даннета ( n ≥ 11). * P < 0,05, ** P < 0,01 и **** P < 0,0001; нс, статистически незначимо. ( M ) Предполагаемые эффекты онкогенной активации BRAF V600E или KRAS G12D на биодоступность лабильных пулов Cu(I).}

Учитывая наши общие результаты, указывающие на то, что Cu(I) кажется менее биодоступным в контексте онкогенной трансформации, мы предположили, что различия в метаболизме глутатиона могут быть движущей силой фенотипа.С этой целью мы протестировали общие уровни GSH и отношения GSH/GSSG в MEF, трансформированных онкогенными BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , и обнаружили, что экспрессия любого из онкогенов увеличивает общий уровень GSH, хотя статистически значимо только в KRAS ^G12D. клеток (рис. 6 G ). К нашему удивлению, отношения GSH/GSSG были значительно ниже в BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , стабильно экспрессирующих MEF, по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 H ). Поскольку MEF, трансформированные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , фенокопировали генетический нокдаун Gsr в отношении сниженной логометрической флуоресценции от FCP-1 и уменьшенного соотношения GSH/GSSG, уровни мРНК Gsr и экспрессия белка были допрошен. При нормализации к контрольным клеткам уровни транскриптов Gsr были значительно снижены при стабильной экспрессии либо BRAF ^V600E , либо KRAS ^G12D , тогда как уровни транскриптов Gclc оставались относительно неизменными среди них (фиг.6 I и J ). Параллельно с уровнями транскриптов Gsr экспрессия белка GSR была снижена в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Напротив, уровни белка GCLC были выше в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Чтобы дополнительно подтвердить связь между онкогенезом, гомеостазом меди и изменениями экспрессии фермента метаболизма глутатиона, как BRAF ^V600E , так и KRAS ^G12D значительно увеличили уровни зеленой флуоресценции CellROX (рис. 6 L ), предполагая, что онкогенная трансформация увеличивает АФК и, в свою очередь, уменьшает лабильный пул Cu(I). Из этих данных мы делаем вывод, что клетки, трансформированные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , обнаруживают лабильный дефицит Cu(I) отчасти из-за сниженных уровней Gsr и повышенных уровней АФК, которые оба могут способствовать более окисленному клеточной среде из-за невозможности регенерировать GSH (рис. 6 M ).

Заключительные замечания

Сложное и динамическое взаимодействие между лабильным и общим пулами металлов оказывает влияние на гомеостаз металлов и дисрегуляцию металлов в здоровых и болезненных состояниях.Медь представляет собой яркий пример этой дихотомии сигнал / стресс, поскольку ее мощная окислительно-восстановительная активность делает ее важным питательным веществом, но та же самая химическая реактивность делает потерю гомеостаза меди опасной для окислительно-восстановительного баланса клетки. Чтобы удовлетворить потребность в новых химических инструментах для исследования лабильных пулов меди, которые будут использоваться в сочетании с дополнительными традиционными методами определения общего содержания меди, мы разработали FCP-1, логометрический FRET-зонд первого поколения, основанный на активности, который позволяет селективно визуализировать лабильные Cu(I) накапливается в живых клетках с самонастраивающимся ответом. FCP-1 использует классический мотив бионеорганического лиганда TPA для Cu(I)-зависимого расщепления, чтобы регулировать FRET между единицами донора флуоресцеина и единицами акцептора родамина дозозависимым образом, обеспечивая высокую специфичность металла и состояния окисления для Cu(I). Благодаря своему логометрическому ответу FCP-1 способен визуализировать динамические изменения уровней лабильного Cu(I) в живых клетках при добавлении меди и/или хелатировании, а также отслеживать снижение уровней эндогенного лабильного Cu(I) в клетках с дефицитом MEF. в транспортере меди CTR1.Действительно, логометрическое считывание FCP-1 с внутренней самокалибровкой двух сигнатур эмиссии является ключевой отличительной чертой для мониторинга базальных уровней лабильного Cu(I) в разных клеточных линиях, так как контрольный зонд FL-TPA, который использует тот же триггер на основе активности, но реагирует только в режиме интенсивности при 1 считывании эмиссии, не может различать лабильный статус Cu(I) между линиями CTR1 дикого типа и линиями нокаута CTR из-за вариабельности загрузки зонда.

На этом фоне мы применили FCP-1 для визуализации изменений в лабильных пулах Cu(I) в условиях окислительно-восстановительного стресса, уделяя особое внимание связи между гомеостазом меди и глутатиона.Действительно, мы наблюдали повышенные уровни лабильного Cu(I) в клетках с нокдауном Gclc , которые обладают более низким количеством общего GSH по сравнению с соответствующими контролями дикого типа, тогда как мы обнаружили более низкие уровни лабильного Cu(I) в Gsr . нокдаун клеток по сравнению с контрольными конгенерами. Эти данные визуализации отслеживают значительное снижение отношения GSH/GSSG в клетках с нокдауном Gsr , но не в клетках с нокдауном Gclc . Кроме того, мы выявили снижение отношения GSH/GSSG в MEF, трансформированных онкогенным BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , что, в свою очередь, вызывает лабильный дефицит Cu(I).В сочетании с тем фактом, что общие уровни меди остаются неизменными в нокдауне Gclc или Gsr и онкогенных клеточных линиях BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , и что мы также наблюдаем более высокую экспрессию белка CCS, который может прочно связывать медь. и более низкие уровни лабильного Cu(I), логометрические измерения флуоресценции FCP-1 показывают, что онкогенная трансформация избирательно влияет на пул лабильного Cu(I) по сравнению с общим пулом меди. Выявив связи между пулом лабильного Cu(I), метаболизмом глутатиона и онкогенной трансформацией, эта работа обеспечивает отправную точку для дальнейшего изучения того, как и почему истощение уровней лабильного Cu(I) может способствовать развитию и прогрессированию рака.Наконец, это исследование мотивирует разработку зондов на основе активности для логометрического обнаружения более широкого набора целевых аналитов в биологических условиях, где самокалибровка может оказаться полезной.

Границы | Преобразование цитохрома P450 2D6 человека в основанный на FRET инструмент для мониторинга аймалицина в живых клетках в режиме реального времени

Введение

Аджмалицин, встречающийся в природе монотерпеноидный индольный алкалоид, представляет собой биоактивное соединение, хорошо известное своей антигипертензивной и противомикробной активностью (Moreno et al. , 1995; Дас и Сатьяпракаш, 2018). Кроме того, он используется для устранения обструкции мозгового кровотока и продемонстрировал свой потенциал в лечении заболеваний системы кровообращения (Misra et al., 2006). Адренергическая блокирующая и центральная депрессантная активность этого алкалоида оценивалась Bhargava and Borison (1957). Также сообщалось о цитотоксической активности аймалицина (Dey and De, 2012). Ранее предполагалось, что аймалицин, наряду с другими гетеройохимбиновыми алкалоидами, действует как предшественник различных оксиндольных алкалоидов, проявляющих множество биологических активностей (Stavrinides et al., 2016). Кора корней R. serpentina и C. roseus , являющихся важными источниками аймалицина, без разбора использовалась для экстенсивного извлечения аймалицина из-за высокого спроса на него (Zheng and Wu, 2004; Mallick et al., 2012; Фулзеле и Намдео, 2018). Кроме того, низкое содержание алкалоидов в растениях требует использования природных источников в больших количествах. В то же время значительное истощение природных источников вызвало озабоченность по поводу состояния окружающей среды (Zafar et al., 2019). Следовательно, требуется устойчивое и усиленное производство за счет тщательного изучения метаболических взаимодействий, участвующих в синтезе алкалоида. Предыдущие попытки повысить продуктивность аймалицина с помощью культур клеточных суспензий, культур во встряхиваемых колбах, культур волосатых корней, методов извлечения и масштабирования в лабораторных условиях, несомненно, способствовали увеличению выхода (Schlatmann et al., 1993; ten Hoopen et al., 1994; Альмагро и др., 2010). Однако осуществимость достижений в более крупном масштабе сталкивается с трудностями непомерно высоких затрат и трудозатрат.Учитывая нынешнюю блокаду на пути повышенной продуктивности алкалоидов, флюксомное исследование могло бы в значительной степени решить проблему, определив регуляторные элементы, влияющие на флюс в метаболическом пути. Флюксомный подход к мониторингу динамики аймалицина in vivo может быть многообещающим в области исследований для понимания сложного взаимосвязанного клеточного метаболизма и может справедливо устранить препятствия, связанные с его низким выходом и производством. Наносенсор FRET, разработанный в настоящем исследовании, дает возможность отслеживать поток аймалицина в режиме реального времени.Это обещает обеспечить высокое пространственное и временное разрешение при изучении потока аймалицина. На сегодняшний день наносенсоры FRET были успешно разработаны для исследований in vivo различных аналитов, таких как лизин (Ameen et al., 2016), глицин-бетаин (Ahmad et al., 2016), цинк (Mohsin et al., 2015). ), глюкоза (Fehr et al., 2003), глутамат (Okumoto et al., 2005) и рибоза (Lager et al., 2003). Учитывая потребность в инструменте, который может отслеживать поток аймалицина в живой системе в реальном времени, в этом исследовании был разработан генетически кодируемый наносенсор на основе FRET.

Наносенсоры FRET следуют общей конструкции, заключающейся в том, что лиганд-связывающий белок, специфичный для анализируемого вещества, помещается между донорным и акцепторным флуоресцентными белками. Выбор лиганд-связывающего белка осуществляется на основе его способности претерпевать конформационные изменения в присутствии целевого аналита. Изменение конформации лиганд-связывающего белка за счет связывания целевого аналита привело к передаче безызлучательной энергии от донорного флуоресцентного белка к акцепторному флуоресцентному белку (пара FRET), проявляя изменение интенсивности излучения флуорофоров.Наносенсор использует переменную интенсивность излучения в качестве меры изменения концентрации метаболита, что помогает в изучении потока. Прелесть этих генетически закодированных наносенсоров на основе FRET заключается в том, что мониторинг метаболитов можно проводить в клетках любого типа и многократно.

Материалы и методы

Разработка химерной конструкции

Человеческий цитохром P450 2D6, белок, связывающий аймалицин, использовался в качестве элемента для связывания аймалицина при разработке наносенсора.Структуру белка анализировали с использованием RCSB PDB (PDB ID-4WNT, разрешение 2,6 Å), а нуклеотидную последовательность гена (CYP2D6), кодирующего белок, извлекали из KEGG (KEGG Entry-1565). кДНК человеческого CYP2D6 была получена от Sinobiologicals Inc., и амплификация гена была достигнута с использованием набора из двух праймеров, 5′- accggt cccctggccgtgatagtggccatctt-3′ (FP) и 5′- ccggt ctagcggggcacagcacaaa-3′. (RP), содержащие сайта рестрикции Age I, обозначенные здесь курсивом.Кроме того, вектор pDh28 использовали для амплификации нуклеотидных последовательностей ECFP и Venus, при этом праймеры были разработаны для добавления сайтов attB 1 и attB 2 на 5′-конце ECFP и 3′-конце Venus, соответственно. Затем сайта рестрикции Age I, содержащих ген CYP2D6, лигировали между 3′-концом ECFP и 5′-концом Venus с получением химерной последовательности ECFP_CYP2D6_Venus, клонированной в векторе pGEM-Teasy (Promega, США). Затем рекомбинантную химерную последовательность вводили в вектор pRSET B (Novagen, Германия) путем рестрикционного расщепления по сайтам Bam HI и Hin dIII.Разработанная рекомбинантная конструкция pRSET-B_ECFP_CYP2D6_Venus была обозначена как FLIP-Ajn (флуоресцентный индикаторный белок для аймалицина). Клонированную конструкцию далее вводили в экспрессионные векторы клеток дрожжей (pYES-DEST52), растений (pEarleyGate100) и животных (pCDNA-DEST-40) с использованием технологии клонирования Gateway (Invitrogen, США). Первоначально pRSET-B_ECFP_CYP2D6_Venus был перемещен в pDONR222 в реакции рекомбинации, опосредованной BP, для создания входного клона (pDONR222_ECFP_CYP2D6_Venus).Затем pDONR222_ECFP_CYP2D6_Venus был перемещен в pYES-DEST52, pEarleyGate100 и pCDNA-DEST-40, генерирующих экспрессионные клоны, pYES-DEST52_ECFP_CYP2D6_Venus, pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus и pCDNA-DEST-40_ECLRFP_CYP2D6-Venus с использованием реакции. Для проверки рекомбинационных конструкций был принят секвенирующий анализ (рис. S1).

Экспрессия и очистка белка наносенсора

Конструкцией FLIP-Ajn трансформировали клетки Escherichia coli BL21(DE3) и позволяли расти при 21°C в течение 24 часов для экспрессии.Рост клеток продолжали до тех пор, пока O.D. ₆₀₀ ~0,6. Затем экспрессию инициировали добавлением синтетического аналога аллолактозы — изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Индуцированные клетки выдерживали в шейкере-инкубаторе при 21°С в течение 48 ч, колбу закрывали крышкой и помещали в темное место. Затем культуру центрифугировали при 4500 g при 4°C в течение 15 мин и растворяли осадок с 20 мМ Tris-Cl (pH 7,5). После этого проводили обработку клеток ультразвуком для высвобождения белка-наносенсора.Белок наносенсора отделяли от клеточного дебриса центрифугированием при 7800 об/мин в течение 30 мин. Сначала супернатант связывали с агарозной смолой Ni-NTA (Qiagen, Германия) в течение 3 ч в чашке Петри и хранили при 4°С. Затем белок дважды промывали в аффинной колонке Ni-NTA His tag ледяным буфером, содержащим 20 мМ Tris-Cl, pH 7,5, и 20 мМ имидазола. Наконец, белок элюировали 20 мМ Tris-Cl, pH 7,5 и 250 мМ имидазолом, и он был сохранен для дальнейшего исследования.

Характеристика наносенсора

Характеристика наносенсора была выполнена с помощью микропланшет-ридера (Synergy h2, Biotek, США). Первоначально спектральный анализ наносенсора проводился путем измерения интенсивности излучения ECFP и Венеры. ECFP подвергали возбуждению на длине волны 430 нм, и эмиссию регистрировали путем спектрального сканирования между 450 и 600 нм с интервалом 10 нм в присутствии и в отсутствие аймалицина. После спектрального анализа исследовали рН-зависимость, специфичность и сродство наносенсора.Фильтры/щели, используемые для анализа, были 430 нм/20 нм для возбуждения ECFP, 485 нм/20 нм для излучения ECFP и 540 нм/20 нм для излучения Венеры. Элюированный белок разбавляли в 20 раз в различных буферных системах, а именно, Tris-Cl, PBS, TBS и MOPS в диапазоне pH 5,5–7,5 для анализа зависимости pH и оптимальной буферной системы для характеристики наносенсора. Тестирование специфичности разработанного наносенсора проводили путем добавления 10 мМ различных ингибиторов/субстратов CYP2D6 к FLIP-Ajn.Этими соединениями были резерпин, ресциннамин, винбластин, винкристин, хинидин, серпентин, тиоридазин и хинин. Аффинность наносенсора осуществляли путем титрования белка наносенсора при различных концентрациях аймалицина. Значение, полученное из отношения интенсивностей излучения Венеры/ECFP (соотношение FRET) при связывании лиганда, обеспечивает меру концентрации субстрата. Аффинность связывания аймалицина (значение K _d ) определяли, применяя следующее уравнение к кривым титрования лиганда:

S = (r – r _апо )/ (r _сат – r _апо ) = [L]/( K _d + [L]), где S – насыщенность; [L] для концентрации аймалицина; г для соотношения; r _apo представляет соотношение без аймалицина, а r _sat с аймалицином.

Мониторинг аймалицина в режиме реального времени

Бактериальные клетки

Разработанную рекомбинантную конструкцию pRSET-B_ECFP_CYP2D6_Venus (FLIP-Ajn) вводили в клетки E. coli BL21(DE3) и выращивали при 37°С (150 об/мин) на шейкере-инкубаторе до О.Д. ₆₀₀ рост бактерий достигал 0,6. Затем клетки обрабатывали 0,5 мМ ИПТГ и выдерживали в течение 24 ч при 21°С при непрерывном встряхивании для экспрессии белка наносенсора. Мониторинг аймалицина в бактериальных клетках в режиме реального времени осуществляли путем добавления 10 мМ аймалицина к бактериальной культуре, помещенной в многолуночные планшеты.Отношения интенсивности излучения Венеры/ECFP регистрировались в течение 30 мин, и данные собирались каждые 5 мин. Контрольный опыт включает бактериальные клетки без аймалицина. Используемые фильтры/щели возбуждения были такими же, как описано в предыдущем анализе.

Клетки дрожжей

Клонированный шлюз pYES-DEST_ECFP_CYP2D6_Venus трансформировали в штамма Saccharomyces cerevisiae /URA3 BY4247. Трансформированные дрожжевые клетки культивировали в синтетической среде определенного состава (SD), содержащей декстрозу (2%) в качестве источника углерода и галактозу (1%) для индукции.Экспрессированные дрожжевые клетки подвергали конфокальному микроскопическому анализу с помощью сканирующей головки Leica TCS-SPE и 63-кратного объектива с иммерсионной системой масла. Экспрессированную культуру снабжали 10 мМ аймалицином. Отношения интенсивностей излучения Венеры/ECFP регистрировались в течение 10 мин, а данные собирались каждые 20 с.

Клетки животных

Клетки HEK-293T (эмбриональной почки человека) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, 10% фетальной телячьей сыворотки и СО ₂ , в шейкере-инкубаторе при 37°C.Опосредованную фосфатом кальция временную трансфекцию клеток HEK-293T с помощью pCDNA_ECFP_CYP2D6_Venus проводили в 6-луночном культуральном планшете и оставляли для экспрессии в течение 2 дней. Промывочный буфер, состоящий из 50 мМ NaCl, 1 мМ MgCl ₂ , 5 мМ KCl, 5 мМ D-глюкозы и 25 мМ HEPES (pH 7,2–7,4). Через 2 дня после трансфекции культивированные клетки устанавливали для анализа изображения с использованием конфокального микроскопа с числовой апертурой 1,53, охлаждаемой камерой с зарядовой связью и иммерсионным масляным объективом с увеличением 63x.В культуру добавляли 10 мМ аймалицина и делали снимки. Отношения интенсивностей излучения Венеры/ECFP регистрировались в течение 10 мин. Лазерная установка, используемая для анализа, была одинаковой как для клеток дрожжей, так и для клеток животных. Данные собирались с интервалом в 20 с, а время экспозиции, установленное для получения изображений, составляло 300 мс.

Растительные клетки

Листовых эксплантата использовали в исследовании для инициации каллюса. Сегменты листьев Catharanthus roseus были собраны в травяном саду Джамия Хамдард, Нью-Дели.Затем собранные эксплантаты непрерывно промывали в течение 20 мин водопроводной водой. Затем экспланты обрабатывали 0,5% цетримидом и 0,1% HgCl ₂ в течение 10 и 5 мин соответственно. Далее проводили последовательную промывку 70% спиртом и стерилизованной дистиллированной водой в течение 1 мин. Культивирование стерильных эксплантов проводили на среде MS (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 0,5 мкМ 2,4-Д, 3% сахарозы и 0,62% агара. рН среды поддерживали на уровне 5,65, а пробирки с культурами хранили в культуральной комнате при температуре 25 ± 2°С.

Agrobacterium tumefaceins штамм EHA105 трансформировали с помощью pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus, и суспензионную культуру инициировали после инокуляции одной колонии трансформированного штамма Agrobacterium в среде LB. В среду добавляли 50 мг/мл канамицина и 50 мг/мл рифампицина, культуру выдерживали при 28°С в течение 36 часов. Затем проводили трансформацию каллусных клеток путем добавления каллусных линий, хранящихся в помещении для культивирования, в культуру суспензии агробактериальных клеток.Культуре давали возможность расти при 28°C (150 об/мин) до тех пор, пока не начиналась оптическая плотность. ₆₀₀ 0,6. Затем экспланты подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и совместно культивировали в течение 3 сут на МС + 100 мкМ ацетосирингона при 25 ± 2°С. После этого экспланты сначала промывали 500 мг/л цефотаксима, а затем дважды стерильной дистиллированной водой. Им снова давали высохнуть и далее перемещали в среду для селекции, содержащую MS, 10 мг/л BASTA, 250 мг/л цефотаксима и 0,5 мкМ 2,4-D. В дальнейшем цефотаксим и антибиотик удаляли из среды, а культуру поддерживали при 16-часовом фотопериоде при 25 ± 2°С.

Суспензионную культуру Catharanthus roseus , трансформированную pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus, исследовали под конфокальным микроскопом Leica с объективом 10x. Культуру подвергали флуоресцентному анализу и после возбуждения на длине волны 430 нм регистрировали соотношение интенсивностей свечения Venus/ECFP. Визуализация выполнялась с использованием отдельных фильтров возбуждения и эмиссии. Для исследования использовали фильтр возбуждения 430 нм, а эмиссионные фильтры 485 нм и 540 нм.Программное обеспечение LAS-AF (Leica, Германия) использовалось для записи коэффициента интенсивности излучения FRET.

Разработка родственных мутантов

Для расширения физиологического диапазона наносенсора аминокислоты лиганд-связывающего кармана аймалицин-связывающего белка подвергали точечной мутации с использованием набора для направленного мутагенеза quick-change (Stratagene, США). Точечные мутации вводили в разные сайты. Фенилаланин в положении 120 заменен на аргинин (F120R), лизин в положении 213 заменен аланином (L213A), глицин в положении 212 заменен глутамином (G212Q), аспарагиновая кислота в положении 301 заменена глицином (D301G).Очистку экспрессии и анализ аффинности разработанных мутантов проводили, как описано в предыдущем разделе.

Результаты

Проектирование и изготовление наносенсора

Цитохром P450 2D6 был успешно преобразован в сенсорный домен для аймалицина. Связывание аймалицина с сайтом связывания лиганда белка вызывало структурные изменения в белке и способствовало безызлучательному переносу энергии между флуоресцентной парой, ECFP и Венерой.N- и C-концы CYP2D6 были присоединены к флуоресцентным остаткам (ECFP и Venus) для удовлетворения потребности в FRET (рис. 1). Успешная разработка рекомбинантной конструкции в векторах экспрессии, включая pRSET-B, была подтверждена путем рестрикционного расщепления, как показано на рисунках S1–S11, а дальнейшее подтверждение было получено с помощью анализа последовательности нуклеотидов (рисунки S1, S13).

Рисунок 1 . Схематическое изображение конструкции наносенсора. (A) Эскиз построенного нанонаносенсора. (B) Краткое описание работы FLIP — Ajn. FRET-ответ наблюдается после введения в систему аймалицина.

Спектральный анализ наносенсора

Экспрессия белка наносенсора подтверждена спектральным анализом. Повышенная интенсивность излучения Венеры была зарегистрирована в присутствии 1 мМ аймалицина (рис. 2). В отсутствие аймалицина интенсивность излучения 140 и 200 а.е. был зарегистрирован при 480 и 540 нм соответственно.Точно так же данные флуоресцентного анализа, полученные при добавлении аймалицина к белку-наносенсору, привели к снижению интенсивности излучения на 120 а.е. вблизи 480 нм и повышенной интенсивности флуоресценции 230 а.е. около 540 нм (рис. 2). Изменение соотношения интенсивностей эмиссий Венера/ECFP в присутствии и в отсутствие самого аймалицина свидетельствовало о возникновении FRET между ECFP и Венерой.

Рисунок 2 . Интенсивность испускания флуоресценции регистрируют в устройстве для считывания микропланшетов в отсутствие и в присутствии 1 мМ аймалицина.Представлен прогресс в интенсивности флуоресценции Венеры.

Эксперимент по титрованию, проведенный с наносенсорным белком и аймалицином в диапазоне от наномолярного до миллимолярного, показал насыщение белка при повышенной концентрации аймалицина. На графике данных была получена сигмоидальная кривая, на которой наблюдалось увеличение отношения FRET от 0,7 до 1,05 при увеличении концентрации аймалицина, а насыщение белка регистрировалось при 1 мМ аймалицина (рис. 3).Аффинность связывания лиганда ( K _d ) FLIP-Ajn была рассчитана как 582 мкМ. Концентрация белка наносенсора составила 0,20 мг/мл.

Рисунок 3 . Сигмоидальный график представляет насыщение FLIP-Ajn при увеличении концентрации аймалицина. Эксперимент проводили с тремя независимыми повторностями. Вертикальные полосы показывают стандартную ошибку набора данных.

Анализ pH-стабильности наносенсора

Анализ стабильности pH in vitro подтвердил отсутствие влияния pH на ожидаемый выход белка наносенсора.Белок-наносенсор был стабилен во всех выбранных для анализа буферах: трис-Cl, PBS, TBS и MOPS. Однако наилучший результат был получен в буфере PBS (рН 7,0). Очищенный белок не показал изменения отношения FRET со значением, близким к 1,1, в отсутствие аймалицина. Однако после добавления аймалицина в буферную систему PBS была зарегистрирована заметная разница в соотношении FRET. Не наблюдалось значительного изменения отношения FRET от pH 5,5 до pH 7,0 (рис. 4).

Рисунок 4 .На рисунке показан анализ рН-стабильности FLIP-Ajn. Очищенный белок растворяли в буфере PBS с различным pH и отслеживали изменение отношения FRET. Черная и желтая линии показывают соотношение FRET, определенное в присутствии и в отсутствие аймалицина (Ajn). Нанесенные на график значения представляют собой среднее значение трех независимых повторов. Вертикальные полосы указывают на стандартную ошибку.

Анализ специфичности наносенсора

Элюированный белок наносенсора, подвергнутый анализу специфичности, показал значительное изменение отношения FRET в присутствии аймалицина по сравнению с контролем.Отношение FRET, равное 1,1, было зафиксировано для белка наносенсора при добавлении 10 мМ аймалицина. Не было обнаружено значительного изменения отношения FRET FLIP-Ajn при добавлении различных субстратов/ингибиторов CYP2D6 (рис. 5), за исключением присутствия хинидина и серпентина, где изменение отношения FRET составляло ~ 0,12 и ~ 0,14 по сравнению с контролем. . Однако это незначительно, так как изменение коэффициента FRET <0,2. Этот анализ подтвердил специфичность CYP2D6 только к аймалицину.

Рисунок 5 .Анализ лиганд-специфичности FLIP-Ajn. Увеличение коэффициента FRET по сравнению с контролем наблюдалось только для аймалицина. Исследование проводили с тремя независимыми повторностями. Вертикальные полосы показывают стандартную ошибку набора данных.

Флип-Айн Мутанты

Четыре мутанта FLIP-Ajn были получены с разной аффинностью с помощью сайт-направленного мутагенеза. Различные наносенсоры имеют разную аффинность связывания и широкий диапазон концентраций от 24 мкМ до -4500 мкМ (таблица 1).Аффинность связывания ( K _d ) для наносенсора дикого типа (WT) была рассчитана как 582 мкМ. Аналогичным образом были рассчитаны константы связывания мутантов. K _d значения для F120R, L213A, G212Q и D301G были рассчитаны как 700, 3000, 38 и 24 соответственно. Максимальное изменение отношения FRET на 0,52 наблюдалось в F120R (рис. 6).

Таблица 1 . Близкие мутанты FLIP-Ajn.

Рисунок 6 . Сигмоидальный график представляет насыщение наносенсора дикого типа (WT) и аффинных мутантов наносенсора (F120R, L213A, G212Q и D301G) при повышении концентрации аймалицина. Исследование проводили с тремя независимыми повторностями. Вертикальные полосы показывают стандартную ошибку набора данных.

Мониторинг потока аймалицина в режиме реального времени в прокариотических и эукариотических системах

Прокариотические (бактерии) и эукариотические (дрожжи и животные) системы, выбранные для мониторинга потока аймалицина в реальном времени, показали повышенный коэффициент FRET в присутствии аймалицина. В бактериальных клетках после наружного добавления аймалицина наблюдалось увеличение коэффициента FRET с 0,2 до 0,4 (рис. 7).Точно так же данные конфокальной визуализации, полученные для потока аймалицина в дрожжевых клетках в реальном времени, показали увеличение отношения FRET с 0,65 до 1,61 в течение 10 минут после добавления аймалицина в культуру (рис. 8). Трансфицированные клетки HEK-293T также показали изменение отношения FRET от 0,4 ± 0,05 при 0 с до 0,85 ± 0,05 при 400 с при добавлении аймалицина, а данные визуализации показали распределение белка наносенсора преимущественно в цитоплазме культивируемых клеток. клетки (рис. 9). Клетки Catharanthus roseus , трансформированные pEarleyDate100_ECFP_CYP2D6_Venus, экспрессировались в цитозоле растительных клеток.Медленное и постоянное добавление аймалицина к суспензионной культуре приводило к увеличению коэффициента FRET с 0,7 до 3,9 (фиг. 10). Не наблюдалось значительного увеличения отношения FRET в отсутствие аймалицина, но добавление более высоких концентраций аймалицина давало данные с высокими изменениями отношения FRET. Изменение соотношения интенсивностей эмиссии свидетельствует о поглощении аймалицина растительными клетками.

Рисунок 7 . Живая клеточная динамика аймалицина в бактериальных клетках.Линейный график представляет увеличение отношения FRET примерно на 0,24 при добавлении 10 мМ аймалицина. Исследование проводили с тремя независимыми повторностями. Вертикальные полосы показывают стандартную ошибку набора данных.

Рисунок 8 . Мониторинг потока аймалицина в дрожжевых клетках. (A) Конфокальные изображения клеток дрожжей, экспрессирующих наносенсорный белок. Изображения представляют ECFP, Венеру и объединенную флуоресценцию. (B) Интенсивность эмиссии FRET FLIP-Ajn, экспрессированного в клетках дрожжей.Увеличение коэффициента FRET ~1, зарегистрированное при добавлении 10 мМ аймалицина.

Рисунок 9 . Мониторинг потока аймалицина в клетках млекопитающих. (A) Конфокальная визуализация трансформированных FLIP-Ajn клеток млекопитающих, изображающая изображения светлого поля, ECFP и Венеры. (B) Изменение соотношения FRET наблюдается в трансформированных клетках HEK-293T. Увеличение коэффициента FRET от 0,4 до 1,08 зафиксировано при добавлении в культуру аймалицина.

Рисунок 10 .Изменение отношения FRET в трансформированных клетках Catharanthus roseus , экспрессирующих наносенсорный белок. Сообщается о значительном увеличении интенсивности излучения Венеры в течение 20 минут.

Обсуждение

Предпосылки для генетически кодируемого наносенсора FRET требуют конформационной гибкости лиганд-связывающего белка, которая должна быть достаточной, чтобы вызвать перенос энергии между прикрепленными флуорофорами (Fehr et al., 2002). Цитохром P450 2D6 связывается с аймалицином, что приводит к изменению открытой структуры белка в результате образования водородной связи Glu-216 с аймалицином, как сообщают Wang et al.(2015). Структурные изменения решетки цитохрома P450 2D6 с аймалицином и без него показаны в дополнительном файле. Об ингибирующих эффектах аймалицина и серпентина на CYP2D6 впервые сообщили Usia et al. (2005). Работа FRET-наносенсора не зависит от активности CYP2D6 из-за ингибирующего действия аймалицина, серпентина и различных субстратов/ингибиторов, выбранных для исследования. Для работы наносенсора необходимы только конформационные изменения CYP2D6 при связывании аймалицина, независимо от результирующей ферментативной активности белка. Конформационная разница, возникшая в аджмалицин-связывающем белке из-за добавления аджмалицина, была достаточной для индукции FRET между ECFP и Venus, как показано на рисунке 2. Хотя тиоридазин, хинидин и хинин вносят конформационные изменения в домен CYP2D6, как сообщает Ван и другие. (2015), изменение отношения FRET, наблюдаемое в присутствии этих субстратов, было незначительным, поскольку изменение отношения FRET составляет <0,2 (рис. 5). Возникновение FRET также зависит от выбора донорно-акцепторных флуорофоров.Пара флуорофоров должна иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь тривиальные различия в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга (Held, 2005). Связывание аймалицина с цитохромом P450 2D6 связывало ECFP и Венеру, что приводило к безызлучательному переносу энергии между флуоресцентной парой, что наблюдалось по изменению интенсивности излучения пары FRET. Измерение отношения FRET, основанное на интенсивности излучения донорных и акцепторных флуорофоров, ранее проводилось для мониторинга аминокислот (Hu et al. , 2017), в исследовании также делается вывод об отсутствии препятствий pH, накладываемых на аффинность наносенсора, что делает его пригодным для мониторинга уровня аймалицина in vivo . Исследование также подтверждает специфичность наносенсора только к аймалицину, что подтверждается значительным увеличением отношения FRET FLIP-Ajn в присутствии аймалицина (рис. 5).

FLIP-Ajn доказал свою превосходную способность контролировать уровень аймалицина в режиме реального времени. Белок наносенсора успешно экспрессируется в бактериальных, дрожжевых, животных и растительных клетках, а ожидаемое изменение отношения FRET, наблюдаемое в исследованных системах, подтверждает успешную разработку наносенсора.Одной из приоритетных задач разработанного наносенсора было определение динамики метаболитов с высоким пространственным и временным разрешением в живых клетках. В частности, FLIP-Ajn показал свою экспрессию в цитозоле дрожжевых клеток и цитоплазме животных клеток, как показано на рисунках 8, 9. FLIP-Ajn также успешно экспрессировался в цитозоле растительных клеток. Дальнейшее добавление целевых последовательностей к белку наносенсора позволит визуализировать различные субкомпартменты клеток и улучшит нашу способность контролировать путь, участвующий в производстве аймалицина.Направление белка наносенсора в субклеточные компартменты ранее было достигнуто в ряде FRET-наносенсоров, а именно, FLIPglu в ядрах (Fehr et al., 2004). Сгенерированные мутанты FRET-наносенсора также расширили область обнаружения наносенсора и, следовательно, обеспечили его полезность при измерении уровней амималицина в широком физиологическом диапазоне.

Заключение

В исследовании сообщается о разработке белка-индикатора флуоресценции для аймалицина путем сэндвичинга CYP2D6 между парой FRET (ECFP и Venus).Было обнаружено, что наносенсор имеет стабильный рН ≥ 7,0, специфичен для аймалицина, т. е. не реагирует на выбранные ингибиторы/субстраты CYP2D6, а аффинность связывания белка наносенсора была рассчитана как 582 мкМ. Экспрессия наносенсорного белка была продемонстрирована в клетках E. coli BL21, Saccharomyces cerevisiae /URA3 штамм BY4247, клетках эмбриональной почки человека (HEK-293T) и суспензионных клетках Catharanthus roseus с помощью флуоресцентного анализа в присутствии аймалицин.В исследовании также были разработаны различные мутанты CYP2D6 посредством сайт-направленного мутагенеза, в результате чего был получен набор наносенсоров с различной аффинностью связывания, которые были бы эффективны для измерения уровней аджмалицина в широком диапазоне концентраций. Наносенсор на основе FRET для аймалицина, FLIP-Ajn, оказался полезным инструментом для изучения потока аймалицина в живых клетках в реальном времени. Экспрессия наносенсора в четырех различных хозяевах, представляющих прокариотические и эукариотические микроорганизмы, а также в клетках животных и растений, успешно использованных в исследовании, позволила отслеживать поток метаболита.Неинвазивность и высокое пространственное и временное разрешение инструмента имеют большое значение для биовизуализации сильно разделенного метаболического пути. Присоединение сигнальных пептидов к наносенсору для экспрессии в определенных компартментах растительных клеток откроет новые двери в понимании сложного пути, действующего в природе. Изучение потока аймалицина также поможет определить этапы регулирования, участвующие в синтезе алкалоида, и, следовательно, эффективно улучшит скорость производства аймалицина из его природных источников.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью/дополнительный материал.

Вклад авторов

GA, AA и MA предусмотрели и разработали эксперименты. GA и AA провели эксперимент. GA, AAA и EA проанализировали данные. GA, AA, AAA, AH, MA и EA составили рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Плата за публикацию оплачивается фондом декана научных исследований Университета короля Сауда за поддержку номера исследовательской группы (RGP-271).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

GA выражает благодарность Совету по научным и промышленным исследованиям правительства. Индии для младших научных стипендий. AAA, AH и EA выражают искреннюю признательность деканату научных исследований Университета короля Сауда за финансирование исследовательской группы под номером (RGP-271).

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2019.00375/full#supplementary-material

.

Каталожные номера

Ахмад М., Амин С., Сиддики Т. О., Хан П. и Ахмад А. (2016). Мониторинг бетаина глицина в живых клетках с помощью генетически кодируемого наносенсора на основе FRET. Биосенс. Биоэлектр. 86, 169–175. doi: 10.1016/j.bios.2016.06.049

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Альмагро, Л., Перес, А.Л., и Педреньо, Массачусетс (2010). Новый метод повышения продукции аймалицина в культурах клеток, основанный на использовании циклодекстринов. Биотехнология. лат. 33, 381–385. doi: 10.1007/s10529-010-0430-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Амин С., Ахмад М., Мохсин М., Куреши М.И., Ибрагим М.М., Абдин и др. (2016). Разработка, конструирование и характеристика генетически кодируемого нанонаносенсора на основе FRET для мониторинга потока лизина в живых клетках в режиме реального времени. J. Нанобиотехнологии. 14:49. doi: 10.1186/s12951-016-0204-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бхаргава, К.П., и Борисон, Х.Л. (1957). Сравнительные эффекты различных алкалоидов Rauwolfia на центрально вызываемые вазопрессорные реакции. J. Pharmacol. Эксп. тер. 119, 395–405.

Реферат PubMed | Академия Google

Дас, А., и Сатьяпракаш, К. (2018). Антимикробные свойства натуральных продуктов: обзор.Фарма. Innovation J. 7, 532–537.

Академия Google

Дей, А. , и Де, Дж. Н. (2012). Ботанические средства против змеиного яда, используемые этническими группами округа Пурулия, Западная Бенгалия, Индия. J. Herbs Spices Med. Растения 18, 152–165. дои: 10.1080/10496475.2011.652298

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Фер, М., Фроммер, В. Б., и Лалонд, С. (2002). Визуализация поглощения мальтозы живыми дрожжевыми клетками с помощью флуоресцентных нанонаносенсоров. Проц. Натл. акад. науч. США 99, 9846–9851. doi: 10.1073/pnas.142089199

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фер М., Лалонд С., Эрхардт Д. В. и Фроммер В. Б. (2004). Живая визуализация гомеостаза глюкозы в ядрах клеток COS-7. J. Флуоресц. 14, 603–609. doi: 10.1023/B:JOFL.0000039347.94943.99

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фер, М., Лалонд, С., Лагер, И., Вольф, М.В. и Фроммер, В. Б. (2003). In vivo визуализация динамики поглощения глюкозы в цитозоле клеток COS-7 с помощью флуоресцентных нанонаносенсоров. Дж. Биол. хим. 278, 19127–19133. дои: 10.1074/jbc.M301333200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фулзеле, Д. П., и Намдео, А. Г. (2018). Экономичное пилотное производство аймалицина с помощью клеточных суспензионных культур Catharanthus roseus в биореакторе объемом 100 л. Биотехнология. Дж. 21, 1–15. дои: 10.9734/BJI/2018/43510

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Хелд, П. (2005). Введение в технологию передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET) и ее применение в биологических науках. Winooski, VT: Примечание по применению Bio-Tek.

Академия Google

Hu, H., Gu, Y., Xu, L., Zou, Y., Wang, A., Tao, R., et al. (2017). Генетически закодированный набор инструментов для отслеживания динамики гистидина в живых клетках в пространстве и времени. Науч.Респ. 7:43479. дои: 10.1038/srep43479

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маллик, С. Р., Йена, Р.К., и Самал, К.С. (2012). Rapid in vitro размножение находящегося под угрозой исчезновения лекарственного растения сарпгандха ( Rauwolfia serpentina ). утра. Дж. Растениевод. 3, 437–442. doi: 10.4236/ajps.2012.34053

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Мисра, Н., Кумар, С., и Лутра, Р. (2006). Биоконверсия аймалицина в серпентин в корнях Catharanthus roseus.Дж. Плант. Науч. 1, 340–347. doi: 10.3923/jps.2006.340.347

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Мохсин М., Диван Х., Хан И. и Ахмад А. (2015). Генетически кодируемый нанонаносенсор на основе FRET для мониторинга in vivo концентрации цинка в физиологической среде живой клетки. Биохим. англ. J. 102, 62–68. doi: 10.1016/j.bej.2015.03.012

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Морено, П. Р., ван дер Хейден, Р.и Верпорт Р. (1995). Культуры клеток и тканей Catharanthus roseus : обзор литературы. Завод. Клетка. Тисс. Орг. 42, 1–25. дои: 10.1007/BF00037677

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Мурасиге, Т., и Скуг, Ф. (1962). Пересмотренная среда для быстрого роста и биоанализа с культурой ткани табака. Физиол. Плантарум. 15, 473–497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Окумото, С., Looger, L.L., Micheva, K.D., Reimer, R.J., Smith, S.J., and Frommer, W.B. (2005). Обнаружение высвобождения глутамата из нейронов с помощью генетически кодируемых поверхностно-дисплеируемых нанонаносенсоров FRET. Проц. Натл. акад. науч. США 102, 8740–8745. doi: 10.1073/pnas.0503274102

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Schlatmann, J.E., Nuutila, A.M., Van Gulik, W.M., Ten Hoopen, HJ, Verpoorte, R. и J Heijnen, J. (1993). Увеличение производства аймалицина культурами клеток растений Catharanthus roseus . Биотехнология. биоинж. 41, 253–262 doi: 10.1002/bit.260410212

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ставринидес А., Татсис Э. С., Капути Л., Фуро Э., Стивенсон С. Э., Лоусон и др. (2016). Структурное исследование синтеза гетеройохимбиновых алкалоидов выявило элементы активного сайта, которые контролируют стереоселективность. Нац. коммун. 7:12116. дои: 10.1038/ncomms12116

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

тен Хупен, Х.J., van Gulik, W.M., Schlatmann, J.E., Moreno, P.R., Vinke, J.L., Heijnen, et al. (1994). Производство аймалицина клеточными культурами Catharanthus roseus : из встряхиваемой колбы в биореактор. Завод. Клетка. Тисс. Орг. 38, 85–91. дои: 10.1007/BF00033865

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Усия Т., Ватабе Т., Кадота С. и Тэдзука Ю. (2005). Компоненты, ингибирующие цитохром P450 2D6 (CYP2D6) Catharanthus roseus . Биол.фарм. Бык. 28, 1021–1024. doi: 10.1248/bpb.28.1021

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, А., Стаут, К.Д., Чжан, К., и Джонсон, Э.Ф. (2015). Вклад ионных взаимодействий и динамики белка в субстрат цитохрома P450 2D6 (CYP2D6) и связывание ингибитора. Дж. Биол. хим. 290, 5092–5104. doi: 10.1074/jbc.M114.627661

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Зафар Н., Муджиб А., Али М., Тонк Д., Гулзар Б., Малик М. и др. (2019). Анализ размера генома выращенной в полевых условиях и регенерированной культуры ткани Rauvolfia serpentina (L) с помощью проточной цитометрии: гистология и сканирующее электронное микроскопическое исследование морфогенеза in vitro. Инд. Урожай. Произв. 128, 545–555. doi: 10.1016/j.indcrop.2018.11.049

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чжэн З. и Ву М. (2004). Обработка кадмием увеличивает производство вторичных метаболитов алкалоидов в Catharanthus roseus . Растениевод. 166, 507–514. doi: 10.1016/j.plantsci.2003.10.022

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Interbase FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики. Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов оснований РНК FRET, состоящей из донора tC ^O и неэмиссионного акцептора tC _nitro . Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезируется и впервые включается в РНК. Эта пара FRET точно описывает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем наблюдения за переходом от A-формы РНК к Z-форме. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ.Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой процесс, при котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором. Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, можно получить информацию о структуре и/или относительном положении различных меченых донором и акцептором биомолекул в физиологических условиях in vitro или даже в живых клетках (2,3). FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и РНК-белковые комплексы, которые нелегко поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4). Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одной молекулы с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для исследования совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния.Например, индуцируемое ионами сворачивание изгибов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6). Одним из способов повысить уровень информации, получаемой с помощью FRET в РНК-системах, было бы использование флуоресцентных аналогов оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например.г. tC ^O (9), тиено[3,4- d ]пиримидины ( ^th A, ^th C, ^th G и ^th U) (10) и изотиазоло[4,3 — d ]пиримидины ( ^tz A, ^tz C, ^tz G и ^tz U) (11), суррогат U с применением в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для исследования G-квадруплекса (13) и расширенных нуклеозидов РНК (xRNAs) (14). Однако FRET между основаниями был исследован только для ДНК с использованием неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC ^O – tC _nitro (15), qAN1–qA _nitro (8) и pA–qA _nitro ). (16)) или излучающий акцептор ( ^th dG–tC) (17).Использование излучающего акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и прямой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы излучения донора и акцептора значительно разделены. Однако большинство высокоэмиссионных FBA излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие излучений может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности в анализ FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции донора (или времени жизни) по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях FRET между основаниями в РНК с использованием пары tC ^O – tC _нитро FRET (рис. 1). Неэмиссионная акцепторная молекула tC _nitro впервые синтезирована и охарактеризована для использования в контексте РНК. В эталонном исследовании мы видим превосходное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК A-формы без существенных признаков структурного возмущения по сравнению с естественным дуплексом РНК A-формы, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования. структурные изменения внутри РНК с высокой точностью.Кроме того, общее использование межбазового FRET для исследования структурных изменений в РНК демонстрируется здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного FRET-донора tC ^O и неэмиссионного FRET-акцептора tC _nitro .

Рисунок 1.

Структура эмиссионного FRET-донора tC ^O и неэмиссионного FRET-акцептора tC _nitro .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика фосфорамидита рибо-ТС _нитро представлены в дополнительных данных.Фосфорамидит рибо-ТС ^О был синтезирован согласно литературным данным (9). Твердофазный синтез tC ^O /tC _нитро -модифицированных олигорибонуклеотидов и их характеристика описаны в дополнительных данных.

Все используемые образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА. Все образцы смешивали и обрабатывали в стерильных средах, не содержащих РНКазы. Концентрацию олигонуклеотида определяли путем измерения поглощения при 260 нм.Молярная абсорбционная способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм была рассчитана с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных нитей была рассчитана таким же образом, с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу в молярной абсорбционной способности между цитозином (ε = 7400 M ^-1 см ^-1 ) и tC ^O ( ϵ = 11000 М ^-1 см ^-1 ) или tC _нитро (ϵ = 9700 М ^-1 см ^-1 ) при 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, использованных для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной нити с равным количеством акцепторной нити при 22°С с ​​последующим быстрым нагреванием до 95°С и, через 10 мин, охлаждение до 5°С при 7,5°С ч ^-1 . Концентрация донорной цепи при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК формы A–Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждая донорная нить была смешана с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5.08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-RNA FRET гибридизовали, как указано выше, с 30% избытком комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной нити со 100% избытком комплементарной ей нити при 22°C с последующим быстрым нагреванием до 75°C и охлаждением через 10 мин. до 55°С при 1,7°С ч ^-1 с последующим охлаждением до 5°С при 60°С ч ^-1 .Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (более высокая концентрация была выбрана для стимулирования гетеродуплексного отжига по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК А-формы, впоследствии разводили до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы разводили фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO ₄ ·H ₂ O (Sigma-Aldrich) для получения в желаемой концентрации NaClO ₄ (8 М, если не указано иное), при этом учитывают полученное изменение плотности раствора (18), а также поправку на различия в концентрации образца (определяют по поглощению при 260 нм) .

Все образцы были измерены сразу после отжига или хранились при температуре -20°C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

Кривые УФ-плавления

РНК регистрировали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым многоклеточным температурным блоком при нагревании от 20°С до 90°С и последующем охлаждении до 20°С со скоростью 0,5°С мин. ⁻¹ . Поглощение при 260 нм регистрировали через каждые 0,5°С в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывали как максимум первой производной кривых УФ-плавления после сглаживания БПФ-фильтром.

Спектры кругового дихроизма (КД) были записаны на CD-спектрометре Chirascan (Applied Photophysics) со сканированием в диапазоне от 200 до 600 нм с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры были скорректированы с учетом фонового вклада.

Измерения флуоресценции

Стационарные эмиссионные спектры регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарных измерениях и измерениях времени жизни. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

Квантовый выход измеряли для дуплексов, содержащих только tC ^O (т. е. без tC _нитро ) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ _f = 54,6%) в 0,5 МН ₂ SO ₄ для справки. Эмиссия регистрировалась между 360 и 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

Время жизни флуоресценции определяли с помощью коррелированного по времени счета одиночных фотонов (TCSPC). Образцы возбуждались импульсным (10 МГц) лазерным диодом PicoQuant с длиной волны 377 нм, а эмиссионный монохроматор был установлен на 460 нм. Подсчеты собирали фотоумножителем R3809U-50 с микроканальной пластиной (Hamamatsu) и вводили в многоканальный анализатор Lifespec (Edinburgh Analytical Instruments) с 2048 каналами. Условие остановки было установлено на 10 000 отсчетов в верхнем канале. Реконволюционную подгонку к би- или триэкспоненциальным функциям выполняли с помощью Fluofit Pro v.4 программное обеспечение (PicoQuant GmbH). Среднее время жизни было взвешено по амплитуде в соответствии с уравнением (1):

$$\begin{equation*}\langle \tau \rangle = \frac{{\mathop \sum \nolimits_i {\alpha _i}{\tau _i}} }{{\mathop \sum \nolimits_i {\alpha _i}}}\end{equation*}$$

(1)где |$\langle \tau \rangle$| — средний срок службы, |${\tau _i}$| — i -е время жизни, а |${\alpha _i}$| — амплитуда i -го времени жизни. Измерения были продублированы. Эффективность FRET была рассчитана на основе стационарного излучения и времени жизни флуоресценции в соответствии с уравнениями (2 и 3):

$$\begin{equation*}E = 1 — \frac{{{I_{{\rm DA }}}}}{{{I _{\rm D}}}}\end{equation*}$$

(2)

$$\begin{equation*}E = 1 — \frac{{{\tau _ {{\rm DA}}}}}{{{\tau _{\rm D}}}}\end{equation*}$$

(3)где I — интегральная интенсивность донора, а τ — средний срок службы донора.6}}\end{equation*}$$

(5)где η – показатель преломления среды (1,4 для биомолекул), Φ _D – квантовый выход донора, Дж ( λ ) — интеграл перекрытия, R _DA — расстояние между донором и акцептором, а κ ² — ориентационный фактор, описывающий относительную ориентацию переходных дипольных моментов донора и акцептора. Зная о фотофизических свойствах пары FRET (Φ _D и J ( λ )) и относительном положении и ориентации донора и акцептора ( R _DA и κ ² ), ожидаемая эффективность переноса была рассчитана с использованием программного обеспечения FRETmatrix на базе MATLAB (19). Протокол немного отличался для A- и Z-формы РНК (рис. 2A), как описано ниже.

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-форм РНК. ( B ) Иллюстрация параметров шести базовых шагов, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-форм РНК. ( B ) Иллюстрация параметров шести базовых шагов, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма

Средние параметры базового шага для A-формы были взяты из Olson et al. (21) На рис. 2B показаны шесть различных параметров базового шага, которые используются для построения моделей нуклеиновых кислот. Чтобы создать плавную кривую, которая направляет взгляд, каждый базовый шаг был разделен на 10 шагов одинакового размера, для которых было рассчитано гипотетическое значение FRET. {\rm{4}}}{\rm{d}}\lambda \end{equation*}$$

(6)где I _D представляет собой зависящий от длины волны спектр излучения донора, нормированный для интегрирования к единице, ϵ _A представляет собой зависящую от длины волны молярную поглощательную способность акцептора, а λ представляет собой длину волны в нм.

Z-форма

Чтобы сделать возможным сравнение между тремя ранее описанными структурами Z-формы (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые являются 6-мерами, и нашей структурой, которая является 14-мером, мы использовали метод, в котором мы расширяем 6-меры ранее опубликованной PDB- файлы в 14-меры с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA, чтобы получить параметры базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных базовых параметров GC и CG для конкретных структур.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базового шага, содержащий 14 пар оснований вместо исходных 6. Наконец, используя эти файлы базового шага, стандартную геометрию спаривания оснований Уотсона-Крика, квантовый выход tC ^O в Z-РНК (Φ _f = 21,3%) и спектральное перекрытие между эмиссией tC ^O и поглощение tC _нитро в Z-РНК ( J _DA = 1,4 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ^-1 см ^-1 ), при различной теоретической эффективности разделения FRET. были рассчитаны с использованием FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез ТС

_нитро

Недавно мы сообщили о синтезе и включении в РНК tC ^O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC ^O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является превосходным FRET донор-кандидат для межбазового FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC _нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).Защищенный 2′-O-TBS рибонуклеозид tC _nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в мультиграммовом масштабе по пятистадийному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 подвергали катализируемому медью перекрестному сочетанию CS с тиолом 2 , что сделало возможным селективное образование связи CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Выход 81%.Трициклическая ароматическая система tC _нитро была построена с конденсацией с замыканием цикла, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по сравнению с межмолекулярной реакцией. Полученный в результате полностью защищенный tC _нитро рибонуклеозид был впоследствии удален с получением соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26, 27) дали желаемый строительный блок tC _нитро -фосфорамидит 5 для включения олигорибонуклеотидов.

Схема 1.

Синтез фосфорамидита ТС _нитро 5 . Реагенты и условия: ( А ) t -Bu ₂ Si(OTf) ₂ , ДМФ, 0°С, 1 ч; затем имидазол, 0°С, 30 мин; затем TBS-Cl, КТ, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60°C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0°C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py·(HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0°C —> КТ, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0°C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, ТГФ, КТ, 20 ч.

Схема 1.

Синтез ТС _нитро фосфорамидит 5 . Реагенты и условия: ( А ) t -Bu ₂ Si(OTf) ₂ , ДМФ, 0°С, 1 ч; затем имидазол, 0°С, 30 мин; затем TBS-Cl, КТ, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60°C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0°C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py·(HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0°C —> КТ, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0°C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, ТГФ, КТ, 20 ч.

Тест FRET РНК А-формы

Для изучения FRET в РНК с использованием tC ^O и tC _nitro мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC ^O , и четыре комплементарные акцепторные последовательности, содержащие tC _nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют образовывать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донора и акцептора. Спектры КД модифицированных tC _нитро дуплексов очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC _нитро не нарушает A-форму (дополнительная фигура S1). Кроме того, свойства УФ-плавления tC _нитро -модифицированных дуплексов указывают на то, что tC _нитро , как и tC ^O , оказывает слегка стабилизирующее действие на А-форму РНК, при этом степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 .4–1,7°С для 5′-C tC _нитро U-3′; 3,9–4,2°С для 5′-U tC _нитро C-3′; Дополнительная таблица S1) (9).

Рисунок 3.

( A ) Последовательности РНК, использованные для исследования характеристик FRET между основаниями в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положение донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазические сайты обозначаются подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, использованных в этом исследовании, см. в дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3.

( A ) Последовательности РНК, использованные для исследования характеристик FRET между основаниями в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положение донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донор-содержащей последовательности. Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазические сайты обозначаются подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, использованных в этом исследовании, см. в дополнительных таблицах S1 и S7.

Флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК приведены в таблице 1. Важно отметить, что tC ^O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), и является превосходным перекрытием длинноволновой полосы излучения tC ^O с полосой поглощения tC _nitro (рис. 4).В предположении свободного вращения переходных дипольных моментов (κ ² = 2/3) теоретическое расстояние Фёрстера для tC ^O – tC _нитро FRET-пары в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.

Таблица 1.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

б

.	λ абс.,макс. [нм] .	ϵ макс. [M −1 см −1 ] .	λ em,max [нм] .	Φ f [%] .	〈τ〉 [нс] .
TC OA	368-373 (370)	7400-9700 (8300)	452-460 (456)	20-25 (22)	3.8-4.7 (4.3)
тС нитро	449-458 (454)	6400-7100 (6800)	—	—

.	λ абс.,макс. [нм] .	ϵ макс. [M −1 см −1 ] .	λ em,max [нм] .	Φ f [%] .	〈τ〉 [нс] .
TC OA	368-373 (370)	7400-9700 (8300)	452-460 (456)	20-25 (22)	3. 8-4.7 (4.3)
TC Nitro B B	449-458 (454)	6400-7100 (6800)	—	—

Таблица 1.

Абсорбчатор флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

б

.	λ абс.,макс. [нм] .	ϵ макс. [M −1 см −1 ] .	λ em,max [нм] .	Φ f [%] .	〈τ〉 [нс] .
TC OA	368-373 (370)	7400-9700 (8300)	452-460 (456)	20-25 (22)	3.8-4.7 (4.3)
тС нитро	449-458 (454)	6400-7100 (6800)	—	—

.	λ абс.,макс. [нм] .	ϵ макс. [M −1 см −1 ] .	λ em,max [нм] .	Φ f [%] .	〈τ〉 [нс] .
TC OA	368-373 (370)	7400-9700 (8300)	452-460 (456)	20-25 (22)	3.8-4.7 (4.3)
TC NITRO B	449-458 (454)	6400-7100 (6800)	—	—

Рисунок 4.

Спектральное перекрытие между излучением tC ^O и поглощением tC _нитро в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Рисунок 4.

Спектральное перекрытие между излучением tC ^O и поглощением tC _нитро в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Для исследования применимости FRET между основаниями с использованием tC ^O и tC _nitro в системах РНК измеренную эффективность FRET сравнивали с теоретическим значением для A-формы РНК, которое было рассчитано на основании установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на В-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET в зависимости от расстояния между донором и акцептором измерялась с использованием как стационарного излучения, так и измерений времени жизни флуоресценции tC ^O в дуплексах с tC _nitro и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок). С2). На рисунке 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC ^O – tC _nitro внутри статических нуклеиновых кислот A-формы и B-формы. Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественных нецелочисленных расстояниях, добавлены к рисунку для ориентации глаз. Локальные минимумы этих кривых возникают из-за разделения, при котором переходные диполи донора и акцептора были бы перпендикулярны друг другу и, следовательно, представляют собой геометрию, при которой в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты не может происходить перенос энергии.

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро в A-форме РНК в зависимости от разделения пар оснований.Голубые ромбы отмечают усредненные данные стационарных измерений и измерений за весь срок службы. Черные ромбы отмечают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _нитро внутри A-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серыми ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC ^O – tC _nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7.4, 123 мМ Na ⁺ .

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро в А-форме РНК в зависимости от разделения пар оснований. Голубые ромбы отмечают усредненные данные стационарных измерений и измерений за весь срок службы. Черные ромбы отмечают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _нитро внутри A-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серыми ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC ^O – tC _nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях.Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Измеренные данные точно следуют предсказанной схеме FRET A-формы, показывая, что аналоги оснований прочно уложены внутри РНК, и убедительно предполагают, что они не нарушают значительно структуру РНК. Следовательно, это сравнительное исследование показывает, что пара tC ^O – tC _nitro FRET отлично подходит для измерений FRET между основаниями в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межбазового FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC ^O и tC _nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), теперь должны быть возможны аналогичные исследования внутри РНК, что делает межосновную FRET с использованием tC ^O – tC _nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

Форма от A до Z FRET

Чтобы проиллюстрировать потенциал этого метода, мы разработали исследование, в котором tC ^O – tC _нитро interbase FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК. Структура правосторонней В-формы ДНК и А-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут иметь левостороннюю структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК впервые была кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае Z-формы ДНК, переход от A-формы РНК к Z-форме происходит преимущественно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые интерферон-ответные белки имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могут отслеживать структурные изменения Z-РНК в живых клеточных системах, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были отправлены в базу данных PDB: исследование ЯМР, где Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 М NaClO ₄ , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование РНК Z-формы вместе с фермент ADAR1 (идентификатор PDB: 2GXB) (31,32).

Чтобы обеспечить сравнение между структурами, депонированными в PDB, и структурами, использованными в этом исследовании, мы применили теорию FRET для предсказания паттернов FRET, ожидаемых от tC ^O – tC _нитро при вставке в разные положения двух олигорибонуклеотидов, каждый из которых содержит структура, соответствующая одной из записей PDB, упомянутых выше (рис. 6А). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретическая картина FRET, полученная с использованием структуры ДНК Z-формы, связанной с ADAR1 (идентификатор PDB: 1QBJ), была включена в качестве дополнительного сравнения (31,33).Как видно на рисунке 6A, теоретическая картина FRET для трех описанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность для изучения конформационных изменений от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК от A до Z была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК от A к Z.Это конформационное изменение обычно отслеживается с помощью CD, что требует инструментов, менее распространенных в научно-исследовательских лабораториях, значительно большего количества образцов, чем измерения флуоресценции, и несовместимо с измерениями в целлюло . Во-вторых, получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для GC-repeat в Z-форме (зеленые круги) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее зарегистрированных структур Z-формы : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, ЯМР-структура Z-формы РНК в 6 М NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанной с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для повторения GC в форме A (черные квадраты) и форме Z (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе от А- к Z-форме. Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ (А-форма) или с добавлением 8 М NaClO ₄ (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение всего срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для GC-repeat в Z-форме (зеленые кружки), вместе с прогнозируемыми значениями FRET для ранее опубликованной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, ЯМР-структура Z-формы РНК в 6 М NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанной с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33). ( B ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _нитро для повторения GC в форме A (черные квадраты) и форме Z (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе от А- к Z-форме. Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатном буфере, рН 7,4, 123 мМ Na ⁺ (А-форма) или с добавлением 8 М NaClO ₄ (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение всего срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпильки и, следовательно, требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3А).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был максимально коротким (14 мер), но при этом позволял исследовать полный оборот спирали, т. Е. Разделение донор-акцептор до 10 п.н. без изнашивания концов. Кроме того, GC-повтор окружен одним абазическим участком и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и повышать стабильность дуплекса, совпадающего внутри каркаса, тогда как абазовые сайты служат гибким линкером, позволяющим формировать GC-повторы. Z-РНК, при этом концы остаются в А-форме.

В этом исследовании для индуцирования Z-формы использовали 8 М NaClO ₄ . Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительная фигура S3), что является еще одним признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их природные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием как стационарного излучения, так и времени жизни флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной и той же цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, картина FRET GC-повторов в A-форме отличается от таковой в эталонном исследовании, где донор и акцептор в противоположных цепях для всех разделений (дополнительная фигура S5). В данных Z-формы есть несоответствие между эффективностью FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для эшелонирования семь и девять (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки сблизило бы донора и акцептора в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение донора может иметь характер прямого контакта (например, перенос электрона Декстера) и, следовательно, происходить во временном масштабе, который невозможно разрешить с помощью нашей установки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах в затухании флуоресценции будет видно только время жизни правильно свернутой части образца, т. е. дуплексов Z-формы РНК, в то время как стационарное излучение будет еще больше тушиться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET. ценность. Поскольку наши результаты показывают разницу между стационарным состоянием и временем жизни FRET при разделении семь и девять и, следовательно, указывают на частичное образование «темных видов» (т. г. шпильки) в этих образцах, для этих точек данных в последующей оценке использовалась только эффективность FRET на основе срока службы (рис. 6).

Сначала мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК от A к Z. Разница в характере FRET между A- и Z-формами РНК поразительна: эффективность переноса изменяется на 25-87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между А- и Z-формы РНК, отслеживая изменение FRET только при одном или паре разделений.Квантовый выход tC ^O практически одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в эффективности переноса связаны со структурными изменениями в РНК, а не с изменениями в микроокружении зонда. В совокупности это показывает, что РНК между основаниями FRET между tC ^O и tC _nitro , разделенными 4–10 п. исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Значительные различия во времени жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК A- и Z-формы указывают на возможность применения микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК, особенно в Z-форме, можно было бы отслеживать в микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным шаблоном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, полученный нами для Z-формы РНК, хорошо согласуется с ранее описанными структурами на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров структур 6mer PDB. Одним из объяснений этих несоответствий может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-мерной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК А-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновских лучей, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически релевантных концентрациях РНК.Учитывая большую редкость отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано подробно комментировать структурное единообразие этой формы дуплекса РНК. Это потребует большего набора сравнительных исследований, касающихся таких аспектов, как длина олигорибонуклеотидов и тип ассоциированного белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC ^O –tC _nitro FRET хорошо подходит для мониторинга межосновного FRET в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и картина FRET близко соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO ₄ , что показывает, что, как и в ДНК, FRET между основаниями РНК можно использовать для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении интервалов tC ^O – tC _nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими PDB-структурами Z-формы РНК мы обнаруживаем общее сходство, но также и значительные различия.Различия аналогичной величины также могут быть обнаружены между структурами PDB, что означает, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли Z-форма РНК одну единую структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и РНК-белковых комплексов по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновной FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстро растущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовую FRET можно проводить в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная польза этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в живых клеточных системах, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновским излучением или ЯМР, для получения новой ценной информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афафа Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение А.Ф.Ф. и М.Б. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 для L.M.W., ID14-0036 для MG]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 to L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

1.

Детхофф

Е.А.

,

Чу

Дж.

,

Мустое

А.М.

,

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция с помощью динамики РНК

.

Природа

.

2012

;

482

:

322

–

330

.2.

Harpur

A.G.

,

Wouters

F.S.

,

Бастианс

П.И.Х.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в одиночных клетках

.

Нац. Биотехнолог.

2001

;

19

:

167

–

169

.3.

Hillger

F.

,

Hanni

D.

,

Nettels

D.

,

Geister

S.

,

Grandin

M.

,

Textor

M.

,

Шулер

Б.

Исследование взаимодействия белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

.

Анжю. хим. Междунар. Эд.

2008

;

47

:

6184

–

6188

.4.

Gubaev

A.

,

Klostermeier

,

Klostermeier

D.

D.

Klostermeier

D.

,

Hammann

C.

RNA Структура и раскладные: биофизические методы и методы прогнозирования

.

2013

;

Берлин

Де Грюйтер

181

–

214

.5.

Пеулен

Т.О.

,

Опанасюк

О.

,

Зайдель

К.А.М.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET с временным разрешением меченых макромолекул

.

J. Phys. хим. Б

.

2017

;

121

:

8211

–

8241

.6.

McPhee

S.A.

,

Huang

L.

,

Lilley

D.M.

Критическая пара оснований в k-витках, придающая характеристики складывания и коррелирующая с биологической функцией

.

Нац. коммун.

2014

;

5

:

5127

.7.

Думат

Б.

,

Ларсен

А.Ф.

,

Вильгельмссон

Л.М.

Рез. нуклеиновых кислот.

2016

;

44

:

e101

.8.

Вранне

М.С.

,

Füchtbauer

AF

,

DUMAT

,

DUMAT

B.

,

BOOT

M.

,

EL-SAGHEER

AH

,

BROWN

T.

,

Gradén

H.

,

Grøtli

M.

,

Wilhelmsson

LM

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

.

Дж. Ам. хим. соц.

2017

;

139

:

9271

–

9280

.9.

Füchtbauer

a.f.f.

A.F.

,

Pruus

S.

,

Börjesson

K.

,

MCHEE

S.A.

,

Lilley

D.M.J.

,

Wilhelmsson

L.M.

Аналог флуоресцентной РНК цитозина – внутренний зонд для детальных структурных и динамических исследований

.

Науч. Респ.

2017

;

7

:

2393

.10.

Шин

Д.

,

Синкельдам

Р.В.

Дж. Ам. хим. соц.

2011

;

133

:

14912

–

14915

.11.

Ровира

А.Р.

,

Fin

A.

,

Tor

Y.

Химический мутагенез эмиссионного РНК — алфавита

.

Дж. Ам. хим. соц.

2015

;

137

:

14602

–

14605

.12.

Се

Ю.

,

Дикс

А.В.

,

Tor

Y.

FRET позволяет в режиме реального времени обнаруживать связывание РНК-малой молекулы

.

Дж. Ам. хим. соц.

2009

;

131

:

17605

–

17614

.13.

Tanpure

А.А.

,

Шриватсан

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве топологически специфичных зондов включения флуоресценции для ДНК и РНК G-квадруплексов

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2015

;

43

:

e149

.14.

Эрнандес

А.Р.

,

Кул

Э.Т.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора рибонуклеозидов увеличенного размера

.

Орг. лат.

2011

;

13

:

676

–

679

.15.

Börjesson

K.

,

Preus

S.

,

El-Sagheer

A.H.

,

BROWN

,

T.

,

T.

,

ALBINSSON

B.

,

WILHELMSSON

L.M.

Л.М.

Нуклеиновая кислота База Аналоговая FRET-пара облегчает детализированные структурные измерения в системах содержащих нуклеиновой кислоты

.

Дж. Ам. хим. соц.

2009

;

131

:

4288

–

4293

.16.

Bood

M.

,

Füchtbauer

A.F.

,

Wranne

M.С.

,

Ро

Дж.Дж.

,

Сарангамат

С.

,

Эль-Сагир

А.Х.

,

Руперт

Д. Л.М.

,

Фишер

Р.С.

,

Magennis

Ю.В.

,

Jones

AC

и др. .

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

.

Хим. науч.

2018

;

9

:

3494

–

3502

.17.

Хан

Дж.Х.

,

Yamamoto

S.

,

Park

S.

,

Sugiyama

H.

Хим. Евро. Дж.

2017

;

23

:

7607

–

7613

.18.

Миллер

М.Л.

,

Доран

М.

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

.

J. Phys. хим.

1956

;

60

:

186

–

189

.19.

Pruus

S.

,

Kilså

K.

,

Miannay

FA

,

ALBINSSON

B.

,

B.

,

Wilhelmsson

LM

Fretmatrix: общая методология для моделирования и анализа FRET в нуклеиновых кислотах

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

;

41

:

e18

.20.

Лу

X.J.

,

Олсон

В.К.

3DNA: пакет программного обеспечения для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2003

;

31

:

5108

–

5121

.21.

Олсон

В.К.

,

Бансал

М.

,

Берли

С.К.

,

Дикерсон

Р.Е.

,

Gerstein

M.

,

Harvey

S.C.

,

Neidle

S.

,

Shakked

Z.

и др. .

Стандартная система отсчета для описания геометрии пар оснований нуклеиновых кислот

.

Дж. Мол. биол.

2001

;

313

:

229

–

237

.22.

SANDIN

P.

,

Börjesson

K.

,

LI

H.

,

Mårtensson

J.

,

BROWN

T.

,

Wilhelmsson

LM

Albinsson

B.

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно ненарушающего флуоресцентного аналога основания ДНК

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2008

;

36

:

157

–

167

.23.

Pruus

S.

,

Börjesson

,

K.

,

Kilså

K.

,

K.

,

ALBINSSON

B.

,

Wilhelmsson

LM

Характеристика аналогового акцептора нуклеобазы _нитро

.

J. Phys. хим. Б.

2010

;

114

:

1050

–

1056

.24.

Чжэн

Г.Х.

,

Лу

Х.Дж.

,

Олсон

В.К.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2009

;

37

:

W240

–

W246

.25.

Серебряный

В.

,

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

.

Тетраэдр Летт.

2002

;

43

:

1983

–

1985

.26.

Sinha

ND

,

Biernat

J.

,

MCMANUS

J.

,

Köster

H.

H.

Полимерная поддержка Олигонуклеотидный синтез XVIII: использование β -цианоэтил- N , N -Диалкиламино-/ N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающий снятие защиты и выделение конечного продукта

.

Рез. нуклеиновых кислот.

1984

;

12

:

4539

–

4557

.27.

XU

Y.

,

I.

,

ISHIZUKA

T.

,

KIMURA

T.

,

KOMIYAMA

M.

M.

A U-TETRAD стабилизирует телемерную РНК РНК «Г-Квадрокс»

.

Дж. Ам. хим. соц.

2010

;

132

:

7231

–

7233

.28.

Ван

А.HJ

,

Куигли

Г.Дж.

,

Колпак

Ф. Дж.

,

Кроуфорд

Дж.Л.

,

Ванбум

Дж.Х.

,

Vandermarel

G.

,

Rich

A.

Молекулярная структура фрагмента левосторонней двойной спирали ДНК с атомным разрешением

.

Природа

.

1979

;

282

:

680

–

686

.29.

Зал

К.

,

Круз

П.

,

Тиноко

И.

,

Джовин

Т.М.

,

Вандесанде

Дж.Х.

Z-РНК — левосторонняя двойная спираль РНК

.

Природа

.

1984

;

311

:

584

–

586

.30.

Зарлинг

Д.А.

,

Калхун

CJ

,

Feuerstein

B.G.

,

Сена

Э.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, ингибирует рост клеток человека

.

Дж. Мол. биол.

1990

;

211

:

147

–

160

.31.

Пласидо

Д.

,

Браун

Б. А.

,

Lowenhaupt

K.

,

Rich

A.

,

ATHANASIADIS

AHANASASIADIS

A.

A A.

Двойная спираль RNA на левшей, связанная Z альфа-редактирование rna-редактирования arzyme ADAR1

.

Структура

.

2007

;

15

:

395

–

404

.32.

Popenda

M.

,

Milecki

J.

,

Adamiak

R.W.

Рез. нуклеиновых кислот.

2004

;

32

:

4044

–

4054

.33.

Шварц

Т.

,

Роулд

М.A.

,

Lowenhaupt

K.

,

Herbert

A.

,

Rich

A.

Кристаллическая структура Z-DNA-домена левостороннего редактирования фермента ADAR1 человека

.

Наука

.

1999

;

284

:

1841

–

1845

.

Примечания автора

© Автор(ы), 2019 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Кевин Фрет, открытый гей-латиноамериканский трэп-исполнитель, застрелен в Пуэрто-Рико

Кевин Фрет, пуэрториканская звезда социальных сетей, объявивший себя первым открытым геем-латиноамериканским трэп-исполнителем, был смертельно ранен в Сан-Хуане рано утром в четверг, согласно в полицию и местные новости.

25-летний г-н Фрет ехал на мотоцикле по району Сантурсе примерно в 5:30 утра, когда в него дважды выстрелили, в голову и бедро, сообщила полиция. Его доставили в ближайшую больницу, где констатировали смерть.

Полиция еще не назвала имя застреленного человека в ожидании опознания тела, но менеджер г-на Фрета, Эдуардо Родригес, подтвердил его смерть в заявлении для Billboard.

Его смерть наступила на фоне всеобщего беспокойства по поводу преступности в Пуэрто-Рико; в среду верхушка Ф.Б.И. Чиновник заявил, что остров столкнулся с «кризисом насилия».

В статье, опубликованной в апреле, журнал Paper Magazine назвал мистера Фрета «первым пионером латинского трэпа, открытым геем». В том же месяце он выпустил сингл «Soy Así» или «I’m Like This».

Видео «Soy Así», которое было просмотрено более 500 000 раз на YouTube, начинается с мистера Фрета, одетого в блестящий укороченный топ и обтягивающие штаны в тон, с винтовкой (предположительно поддельной). В окружении женщин в откровенных нарядах он хвастается своей внешностью, макияжем и дизайнерской экипировкой и называет себя «реинкарнацией Фриды Кало».

«Я человек, которому все равно, что говорят другие», — сказал он журналу.

«Молодые геи или молодые лесбиянки, которые сейчас смотрят на меня как на образец для подражания, типа «вау», если он это сделал, и ему все равно, что говорят другие, я могу это сделать.

Латинский трэп зародился на Карибах в середине 2000-х, смешав южный хип-хоп с местными звуками. Bad Bunny, Messiah и Ozuna — все они работали с Cardi B — являются одними из самых известных практиков.

В заявлении для Billboard менеджер г-на Фрета, г-н Родригес, сказал, что его клиент был «художником и мечтателем с большим сердцем».

«Его страстью была музыка, — добавил он, — и еще многое нужно было сделать».

В июле мистер Фрет снялся в клипе артиста Майка Дюрана на песню «Diferente.Были знакомые тропы — деньги, бикини — но появление мистера Фрета, читающего рэп в радужной сетчатой ​​футболке в джакузи, а позже в белоснежной рубашке с блестящей короной и невероятно длинными ресницами — было, по сути, Очень разные.

Сэми Немир Оливарес, пуэрториканский писатель и активист, проживающий в Нью-Йорке, сказал, что г-н Фрет олицетворяет надежду для таких людей, как он сам, которые столкнулись с издевательствами и преследованиями из-за своей сексуальной ориентации.

«Кевин Фрет представил освежающий взгляд на музыкальный жанр, который очень гомофобный и очень мачистистский», — сказал он.

Г-н Фрет использовал хвастовство и перформативность жанра, чтобы доказать инклюзивность, утверждал г-н Немир Оливарес.

«В Пуэрто-Рико это акт сопротивления», — добавил он.

Но не всегда все шло гладко. Г-н Фрет жестко отреагировал после того, как стал объектом гомофобных угроз в текстах песен конкурирующего артиста, что оставило некоторые сомнения в том, что его убийство было мотивировано ненавистью.

Полиция разыскивала еще одного мужчину на мотоцикле, который был с Мистером Уилсоном.Раздражался, когда его нашли, но быстро сбежал. О мотивах пока не сообщается.

Мистер Фрет тоже жил в Майами в последние месяцы. В июне ему предъявили обвинение в нанесении побоев после драки в районе Брикелл. Мистер Фрет сказал, что на него напали из-за его сексуальной ориентации.

У него было много подписчиков в Instagram, но в четверг не было видно ни одной публикации, что указывает на то, что он, возможно, удалил предыдущие публикации. Была только одна «история»: религиозное изречение, которое переводится как «Молись, расслабься и позволь Богу сделать все остальное.”

Молекулярные детерминанты контактов ЭР–Гольджи, идентифицированные с помощью новой системы FRET–FLIM | Журнал клеточной биологии

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе потребности идентифицированных хитов в поддержании ERTGoCS, и, в частности, зависело ли это от их активности переноса липидов. ORP10 ассоциируется с микротрубочками, а также с комплексом Гольджи (рис. 5А; Nissilä et al., 2012), и, не обладая каноническим доменом FFAT, может взаимодействовать с VAP (Weber-Boyvat et al., 2015; Мерфи и Левин, 2016). ORP10 принадлежит к подсемейству ORP, которое включает членов, которые могут передавать PS (Maeda et al., 2013), такие как ORP5 и ORP8, которые передают PS в обмен на PI4P между ER и PM (Chung et al., 2015), в то время как Было показано, что сам ORP10 связывает и экстрагирует PS (Maeda et al., 2013). Мы заметили, что остатки oxysterol-related domain (ORD) ORP5/ORP8, которые участвуют в обмене PS/PI4P (Chung et al., 2015), очень хорошо консервативны в ORP10 (Fig. 5B).Чтобы выяснить, связана ли потребность в ORP10 в поддержании ERTGoCS со структурной ролью или с его активностью по переносу липидов, устойчивый к siRNA ORP10 был реэкспрессирован в клетках с истощенным ORP10, как в его форме WT, так и в формах, где сайты ORD участвуют в Связывание PS (L418D) и PI4P (H535/536A) было мутировано (фиг. 5B). Мы обнаружили, что WT, но не мутантные формы ORP10, которые были правильно нацелены на комплекс Гольджи (рис. 5C), могут восстанавливать ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис.5D и рис. S3, A и B), что указывает на то, что активность ORP10 по переносу липидов необходима для стабильности этих MCS. PS синтезируется в ER, но обогащен в PM, TGN и эндосомах (Leventis, Grinstein, 2010; Fairn et al., 2011), где он асимметрично распределен между двуслойными листками, ограничиваясь цитозольным листком. Таким образом, мы проверили возможность того, что ORP10 может участвовать в переносе PS из ER в цитозольный листок мембран TGN, изучая влияние истощения ORP10 на субклеточное распределение PS с использованием двух различных генетически кодируемых зондов: PS-связывающий домен лактадгерина (домен C2; Yeung et al., 2008; рис. 5 E) и эвектина (домен PH; Uchida et al., 2011; рис. S3 C). Мы обнаружили, что истощение ORP10 вызывало снижение PS на аппарате Гольджи, что оценивалось по распределению двух зондов PS (рис. 5 E и рис. S3 C), что показало заметное снижение пула Golgi (но не PM). пул) в клетках ORP10-KD, а также по наблюдению за тем, что меньшее количество мембран TGN из клеток ORP10-KD сохранялось на PS-аффинных шариках по сравнению с контрольными клетками (рис. S3 D).

Таким образом, ORP10 требуется для защиты содержимого PS в TGN и, в то же время, ERTGoCS (рис.4, А–Ф; рис. 5 Д; и рис. S3, C и D), что указывает на то, что липидный состав TGN и, в частности, содержание в нем PS имеет решающее значение для создания/поддержания этих структур. Подтверждая эту гипотезу, экзогенное добавление PS частично восстанавливало ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис. 5 F). Сходные результаты были получены, когда производство PS было усилено за счет сверхэкспрессии мутантной (P269S) формы PS-синтазы 1, которая нечувствительна к ингибированию продукта (Sousa et al., 2014; Зон и др., 2016; Рис. 5 G и Рис. S3 E).

Мы рассмотрели тот же вопрос (т.