Рахул Рой

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии Университета Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр исследований Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

¹ Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования поверхности полиэтиленгликоля (PEG 9)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Аннотация

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Отчасти это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) по Фёрстеру (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих общепринятых протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » ¹ .Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это ^{2, 3} . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели, мы предлагаем краткое, но практическое руководство для измерения одиночных молекул FRET ⁴ (smFRET) ^5-7 , одного из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного зарождения в неводных условиях в 1996 г. ⁸ smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, сворачивании и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, сворачивании белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в данной области и ссылкам в них ^{6, 9-13} .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () ^{4, 14, 15} . Эта эффективность передачи энергии, E , задается как E = [1 + ( R / R ₀ ) ⁶ ] ^-1 , где R — расстояние между красителями. и R ₀ — это радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределения популяций расстояний между красителями ^16-19 .Однако возможность контролировать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя конфокальная микроскопия может использоваться ^{20, 21} , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных ^{5, 22} . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией ⁷ с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка также могут быть применены для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R ₀ = 50 Å. Донорский краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R ₀ , E = 0,5, а на меньших расстояниях> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R ₀ .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых рассчитывается кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки ⁹³ , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (∼9 с) или полностью фотообесцвечивается (∼18,5 с).

Box 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R ₀ . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор тушится с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

Схема эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции ε > 50 000 M ⁻¹ см ⁻¹ ; квантовый выход QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством химикатов биоконъюгации.Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET ²³ , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET ²⁴ за счет химического подавления их мерцания ²⁵ , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры — это небольшие (<1 нм) органические красители ²⁶ . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, Alexa- и Atto-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Суа Мён, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат в качестве эффективных однокомолекулярных красителей и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждаемых позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

Повышение фотостабильности

Состояние молекулярного кислорода для эффективного гасителя красителя также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание ²⁷ . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии ²⁸ , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода ²⁸ . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 ²⁸ , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения сверхвысокого разрешения ²⁹ .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей ³⁰ .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода ³¹ представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за выработки глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатехуиновая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа ³² , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места для маркировки должны быть выбраны таким образом, чтобы расстояние между красителями изменилось с меньшего на большее, чем значение R ₀ (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET ³³ , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот ^{34, 35} . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители должны быть конъюгированы изнутри с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу ³⁶ , генетически кодируемую в геликазе Rep E.coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

выход с приемлемой флуоресценцией был бедным.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза ^{37, 38} ) с помощью реакций на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы ^{26, 39} .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Обнаружение одиночных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии ^{40, 41} создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для обсуждаемых здесь пар FRET, а для проверки наличия акцептора можно добавить гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (размером ∼0,05 мм ² ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки — М, зеркальные; DM — дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения CCD. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается бок о бок на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В режиме PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ _c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с использованием щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под ^{40, 41} (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирается с использованием иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов с закачкой жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, создает ПВО на границе раздела стекло / вода ^{40, 41} (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

TIR-микроскопия приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых камер с электронно-умножением на заряженные пары (EM-CCD) с передачей кадров ^{3, 42} . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые имеют высокую квантовую эффективность (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низкий эффективный шум считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстрое скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения таким образом, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора можно отображать на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров между каналами обнаружения возникают значительные перекрестные помехи (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность ⁴³ . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

Хотя кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные покровные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин ^{5, 22, 44} .В эффективном методе исследований, включающих только нуклеиновые кислоты, используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на стеклянных / кварцевых поверхностях и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин — менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (PEG) ⁴⁵ . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () ⁴⁴ (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом ⁴⁶ . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами ^{47, 48} . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с использованием хелатных групп Ni ²⁺ или Cu ^{2+ 49} , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидинового тега и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Юдзи Ишицука, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифично связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).( b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвича с белком нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Покрытые ПЭГ поверхности могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni ²⁺ или Cu ²⁺ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Ярлыки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри фосфолипидных везикул, связанных с поверхностью ^50-52 имитирует клеточный захват, снижает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков ⁵³ , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем наложения двусторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм ² ), препарат на слайде считается приемлемым. После стрептавидина добавляются биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образцов состоит из предметного стекла микроскопа и покровного стекла с двусторонней лентой и путем герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с исх. ^{исх. 7} с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в акцепторный канал (ы) и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализующиеся донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (что соответствует площади ∼ 1 мкм ² ), интегрируются, чтобы восстановить интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы ⁵⁴ , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по кривым интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах, кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E _app = I _A / ( I _A + I _D ), где I _A и I _D представляют интенсивности акцептора и донора соответственно. E _app предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ ² между двумя флуорофорами и необходимыми инструментальными поправками. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ ² близка к 2/3 ^{34, 55} . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент, γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI _A к изменению интенсивности донора, ΔI _D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI _A IΔI _Д ) ^{21, 56} .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около ^{57, 58} . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в окрестности ^59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей доноров и акцепторов), I total, должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I _итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

3. Следует снимать длинные видеоролики, демонстрирующие одноэтапные события фотообесцвечивания, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) ⁶² — хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило состоит в том, что если FRET мгновенно падает до уровня только донора ( E _app = 0), считайте, что это мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии подавителей мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения ²⁸ .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о свойствах равновесия лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающих стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния ⁶³ , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстрые для надежных определение времени пребывания ⁶⁴ .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки количества заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние ⁶⁵ (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных к конечным значениям FRET для каждого перехода, полученный из анализа HMM (или другого), обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных ^{57, 65-67} .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном ^68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции отдельного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом ⁷¹ .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода до того, как кто-то спроектирует первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК ^{72, 73} и многих белков ^{74, 75} .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной разметке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид, являющийся только донором, обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R ₀ = 5 нм.Однако изменение расстояния до 0,3 нм может быть обнаружено для одиночных молекул между 0,6 R ₀ и 1,5 R ₀ , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 ⁵ фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 ³ точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации ⁷⁶ , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями ^{77, 78} . Обеспокоенность по поводу этих проблем можно было бы дополнительно уменьшить, используя избыточное количество ограничений расстояния в исследованиях триангуляции ^{79, 80} .

Усовершенствованные методы smFRET

Некоторые из новых и интересных технических разработок, все еще находящихся на стадии проверки принципа работы, кратко излагаются ниже.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения двусмысленностей. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных ⁴³ .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами ^{81, 82} . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных видов ^{83, 84} недавно была расширена до трехцветной FRET ⁸⁵ .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК ⁸⁶ .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расшифровки флуоресценции одиночных молекул ⁸⁷ и FRET ⁸⁸ , чтобы сообщить о принудительном распаковке шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК ⁸⁹ . Совсем недавно реакция одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживалась с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складывающегося ландшафта ⁹⁰ . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина ^{91, 92} .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы хорошо зарекомендовавшего себя smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще не разработаны, — это измерения в живой клетке, что, вероятно, требует существенного улучшения зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть наши «одномолекулярные» глаза на огромное количество биомолекулярных взаимодействий, которые требуют тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивации поверхности полиэтиленгликоля (ПЭГ)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и выброса МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждения, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа над FRET с одной молекулой финансировалась Национальными институтами здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

Снижение количества ложных срабатываний и улучшенная отчетность об изотермической амплификации, опосредованной петлей, с использованием гашеных флуоресцентных праймеров

(PDF) Ассимилирующий зонд на основе FRET для последовательного мониторинга изотермического усиления в режиме реального времени (LAMP)

4 (2): 81-100 95

Габриэль Д., К. Аллен, М. Шелл, Т. Денни, Дж. Джин, К. Хуанг, Г. Престинг, Д. Норман, З.

Флорес, Ю. Дуан, Дж. Редди, Дж. Эльфинстон, Л. Лю, В. Фармери, Э.Гонсалес, М. Патнаикуни,

Б. Балог, А. Альварес, В. Малхоланд и Г. Саддлер. 2005. Идентификация уникальных ORF

для выбранного агента: Ralstonia solanacearum race 3, биовар 2. Фитопатология 95 (6): S32-S33.

Giglio, S., P. T. Monis, and C. P. Saint. 2003. Демонстрация преимущественного связывания SYBR

Green I со специфическими фрагментами ДНК в мультиплексной ПЦР в реальном времени. Nucleic Acids Res. 31 (22):

e136.

Gill, P., and A. Ghaemi.2008. Технологии изотермической амплификации нуклеиновых кислот: обзор.

Нуклеозиды Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты 27 (3): 224-243.

Gudnason, H., M. Dufva, D. D. Bang, and A. Wolff. 2007. Сравнение нескольких красителей ДНК

для ПЦР в реальном времени: влияние концентрации красителя и состава последовательности на амплификацию ДНК

и температуру плавления. Nucleic Acids Res. 35 (19): e127.

Хатано, Б., Т. Маки, Т. Обара, Х. Фукумото, К. Хагисава, Ю. Мацусита, А.Окутани, Б.

Базарцерен, С. Иноуэ, Т. Сата и Х. Катано. 2010. ЛАМПА, использующая одноразовый карманный обогреватель

для обнаружения сибирской язвы, высокомобильный и надежный метод борьбы с биотерроризмом.

Japanese J. Infectious Dis. 63 (1): 36-40.

Хейд К. А., Дж. Стивенс, К. Дж. Ливак и П. М. Уильямс. 1996. Количественная ПЦР в реальном времени.

Genome Res. 6 (10): 986-994.

Хонг, Т. К., К. Л. Май, Д. В. Куонг, М. Парида, Х. Минекава, Т. Нотоми, Ф.Hasebe, and K.

Morita. 2004. Разработка и оценка нового метода петлевой изотермической амплификации

для быстрого выявления коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома. J

Clin. Microbiol. 42 (5): 1956-1961.

Се, Т. М., К. Х. Луо, Ф. К. Хуанг, Дж. Х. Ван, Л. Дж. Чиен и Г. Б. Ли. 2008.

Повышение термической однородности микротермического циклера и его применение для полимеразной цепной реакции

. Датчики и исполнительные механизмы B 130 (2): 848-856.

Кислинг, Т., К. Кокс, Э. А. Дэвидсон, К. Дретчен, Г. Тертер, С. Хиббард, Р. С. Ласкен, Дж.

Лешин, Э. Сковронски и М. Даниэльсен. 2007. Последовательно-специфическое обнаружение ДНК с использованием

амплификации сигнала никелирующей эндонуклеазы (NESA). Nucleic Acids Res. 35 (18): e117.

Ким, Х., С. Диксит, К. Дж. Грин и Г. В. Фарис. 2009. Нанокапельная система ПЦР в реальном времени с лазерным нагревом

. Оптика Экспресс 17 (1): 218-227.

Кубота, Р., Б. Г. Вайн, А. М. Альварес и Д. М. Дженкинс. 2008. Обнаружение Ralstonia

solanacearum с помощью петлевой изотермической амплификации. Phytopathology 98 (9): 1045-

1051.

Кубота Р., Г. Д. Пекхэм, А. М. Альварес и Д. М. Дженкинс. 2009. Использование молекулярных маяков

для прямого обнаружения ампликонов петлевой изотермической амплификации (LAMP) патогена растений

Ralstonia solanacearum. Фитопатология 99 (6): S68-S68.

Кубота, Р., П. Лабарр, Дж. Синглтон, А. Беддо, Б. Х. Вейгл, А. М. Альварес и Д. М.

Jenkins. 2011a. Неинструментальная амплификация нуклеиновых кислот (NINA) для быстрого обнаружения биовара

Ralstonia solanacearum race 3 2. Biological Eng. Пер. 4 (2): 69-80.

Кубота Р., М. А. Шелл, Г. Д. Пекхэм, Дж. Рю, А. М. Альварес, К. Аллен и Д. М. Дженкинс.

2011б. Вычитание генома in silico направляет разработку высокоточной диагностики

на основе ДНК для биовара 2 Ralstonia solanacearum race 3 и бактерий, вызывающих заболевание крови.J.

Общая патология растений 77 (3): 182-193.

Лиен, К. Ю., В. Ю. Линь, Ю. Ф. Ли, К. Х. Ван, Х. Ю. Лей и Г. Б. Ли. 2008. Системы Microfluidic

, интегрированные с устройством предварительной обработки образцов для быстрой амплификации нуклеиновых кислот. J.

Microelectromech. Системы 17 (2): 288-301.

Махджуб С., К. Вафай и Н. Р. Бир. 2008. Быстрый микрофлюидный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот полимеразы

с цепной реакцией. Intl. J. Тепло- и массообмен 51 (9-10): 2109-

2122.

Мальтезос, Г., А. Гомес, Дж. Чжонг, Ф. А. Гомес и А. Шерер. 2008. Полимеразная цепная реакция Microfluidic

. Applied Physics Letters 93 (24): 243901.

Mao, F., W. Y. Leung и X. Xin. 2007. Характеристика EvaGreen и последствия

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

8.8: Обратная транскрипция — Биология LibreTexts

Согласно центральной догме, ДНК кодирует мРНК, которая кодирует белок. Одно известное исключение из центральной догмы — ретровирусы. У этих РНК-кодируемых вирусов есть фаза в их жизненном цикле, в которой их геномная РНК преобразуется обратно в ДНК с помощью кодируемого вирусом фермента, известного как обратная транскриптаза.Способность преобразовывать РНК в ДНК — метод, который желателен в лаборатории по многим причинам. Например, преобразование представляющих интерес РНК в кДНК используется в ОТ-ПЦР, а также в других приложениях, таких как анализ микрочипов.

Процесс

Во-первых, создается ДНК-олигонуклеотид, который служит в качестве праймера для обратной транскриптазы для использования на целевой РНК. Праймер, конечно, должен быть комплементарным сегменту (около 3 ’конца) РНК, подлежащей амплификации. Смешивают РНК, обратную транскриптазу, праймер и четыре dNTP.За один раунд репликации РНК превращается в одну цепь ДНК. Денатурация освобождает одноцепочечную кДНК, которую можно использовать как есть или преобразовать в двухцепочечную кДНК, в зависимости от применения.

Рисунок 8.37 — Обратная транскриптаза ВИЧ. Функция нуклеазы необходима для жизненного цикла вируса, но не для лабораторного использования. Википедия

Обнаружение молекулярных взаимодействий

Изучение биохимии — это в основном изучение взаимодействия клеточных молекул.По этой причине методы обнаружения взаимодействий между биомолекулами очень полезны для биохимиков. Теперь мы обсудим пару очень разных методов обнаружения этих межмолекулярных взаимодействий.

Дрожжевая двугибридная система (Y2H)

Скрининг двугибридных дрожжей — это сложный метод определения того, какой белок (белки) из набора всех белков клетки взаимодействует с конкретным представляющим интерес белком.Метод основан на взаимодействии между двумя белками для восстановления функционального активатора транскрипции в дрожжевых клетках. Вы можете помнить, что многие активаторы транскрипции представляют собой модульные белки, у которых есть домен, который связывается с ДНК, и другой домен, который активирует транскрипцию (рис. 8.38).

Если фактор транскрипции расщеплен, так что связывающий домен прикреплен к одному белку, а домен активации — к другому белку, функциональный активатор транскрипции может быть воссоздан только в том случае, если два «несущих» белка находятся в непосредственной близости, т.е. есть, они взаимодействуют.Присутствие этого функционального активатора можно определить по экспрессии репортерного гена.

Простой способ понять эту идею — представить активатор транскрипции как устройство, подобное фонарику, которое состоит из двух частей, батареи и лампы, которые должны быть вместе, чтобы функционировать. Ни человек, у которого есть только батарейка, ни тот, у кого есть только лампа, не смогут видеть в темной комнате. Но если эти двое взаимодействуют, подойдя достаточно близко, чтобы вставить батарею в фонарик, их взаимодействие можно обнаружить по тому факту, что фонарик теперь будет работать, о чем свидетельствует излучаемый свет.

Для танго нужны двое

На рис. 8.39 (A) показан нормальный активатор транскрипции дрожжей, GAL4, с ДНК-связывающими (DBD) и активационными доменами (AD). Он способен стимулировать транскрипцию нижележащего репортерного гена lac z. На панелях B и C показаны конструкции, которые продуцируют GAL4 DBD и AD, соответственно, слитые с другими белками, один из которых называется «приманкой», а другой — «добычей». Ни один из этих гибридных белков не может стимулировать транскрипцию гена lac z.Когда конструкции, кодирующие и приманку, и жертву, находятся в одной и той же дрожжевой клетке, если белок приманки взаимодействует с добычей, DBD и AD GAL4 будут объединены, чтобы восстановить функциональный GAL4. Присутствие функционального GAL4 легко обнаружить, поскольку он будет стимулировать экспрессию репортерного гена lac z. Если белки приманки и жертвы не взаимодействуют, то экспрессии lac z не будет. Когда взаимодействие обнаруживается посредством экспрессии репортерного гена, затем можно идентифицировать конкретный белок жертвы.

Дрожжевая двугибридная система позволяет проводить одновременный скрининг многих белков-жертв путем создания больших коллекций слитых конструкций, при этом каждый потенциальный белок-партнер белка-приманки слит с доменом активации GAL4.

Рисунок 8.39 — Четыре сценария дрожжевой двугибридной системы. UAS = Upstream Activator Sequences — действует как промоутер. Сценарий A показывает, что два фактора транскрипции начинаются как один белок. Википедия

Какие стойки подходят для лада гранта.Амортизаторы на лад грант. Порядок снятия модуля передней стойки в сборе на Лада Гранта

Конструкция передних стоек автомобиля Лада Гранта телескопическая, что позволяет заменять конкретный вышедший из строя элемент. Для этого нужно всего лишь разобрать стеллаж на отдельные части. Для детального рассмотрения данной операции потребуется обратить внимание на манипуляции с одной из стоек, так как вторая ремонтируется совершенно аналогично.Лучшим подспорьем в работе станет подвешивание машины на подъемнике по сравнению с подъемом обычным домкратом. В последнем случае поместите автомобиль LADA Granta на ровную поверхность. Также нужно знать, какие стойки лучше ставить.

Подготовительные процедуры

Многих автовладельцев интересует, какие стойки лучше поставить, а также как все сделать правильно. Перед ремонтом передних стоек вам понадобятся:

1. Останавливаем автомобиль LADA Granta ручным тормозом и подкладываем под кормовые колеса колодки.
2. Под капотом находим шток амортизатора, в шестигранную выемку которого, расположенную на торце, вставляем ключ соответствующего профиля.
3. Вторым ключом ослабить момент затяжки гайки крепления элемента подвески к кузову. А пока держим шток шестигранным ключом от желания крутить заодно с гайкой.
4. «Ныряем» в колесную арку LADA Granta и находим кронштейн, который удерживает тормозной шланг на корпусе стойки.
5. Откручиваем указанный крепеж, сняв сам шланг с держателя. Это даст место для откручивания нижней опоры стойки. Придется работать в паре с ключом типоразмера «17».

Стоит рискнуть заменить стойки в тех случаях, когда обнаружен факт утечки рабочей жидкости из амортизатора, а также при появлении детонации, деформации штока или разрушения сайлентблока.

Следует помнить о правиле, что стойки заменяют комплексно на одной оси, даже если второй амортизирующий элемент исправен.

Какие инструменты выбрать?

1. Ключ шестигранный размером «6».
2. Обычные (можно использовать торцевые) ключи, стандартные размеры которых следующие: «13», «17», «19» и «22».

Как снять пружину и амортизатор на Гранте?

1. Если комплектация автомобиля подразумевает наличие системы АБС, то перед тем, как начинать процесс ремонта с амортизаторами и пружинами, необходимо обязательно демонтировать датчик этого блока безопасности.
2. Теперь можно отсоединить рулевую тягу. Эта манипуляция предполагает одновременное отсоединение наконечника рулевого механизма от шарнирного рычага, расположенного на амортизаторе.
3. Чтобы не допустить большой погрешности в углах установки обоих колес Лада Грант, требуется перед разборкой разметить место расположения верхнего болта шайбой, с помощью которой крепится элемент подвески к шкворню своим кронштейном. Для этого подойдет обычный маркер.Такое нехитрое действие позволит вам спокойно добраться до сервиса, чтобы впоследствии скорректировать выпуклость и мысок. Да и на ходу машина не будет так явно стремиться к уходу в сторону.
4. Откручиваем болты крепления стойки и кулака. Сначала отпускаем верхний болт в паре с эксцентриковой шайбой, а затем снимаем нижний фиксатор. Теперь настал момент отсоединить стойку от цапфы. Мы с гордостью выполняем эту акцию.
5. Возвращаемся под капот. Находим три точки (орехи).Это точка крепления амортизатора к чашке корпуса лонжерона. Гайки ослабляют равномерно (по очереди, но на небольшую величину). Это предотвратит перекос стойки. Сам демпфирующий элемент поддерживается с внутренней стороны колесной арки, чтобы не вызвать ее падение. Все мероприятие осуществляется с помощью клавиши на «13».
6. Сделав победу над гайками, торжественно снимаем стойку.
7. Используем стяжки для пружинных элементов. Процесс зажатия катушки этими устройствами осуществляется до момента освобождения пружины от тяги между стойкой и опорными чашками.
8. Убедившись, что пружина свободна, отверните гайку центрального штока ключом на «22».
9. Теперь приступим к разборке стойки. Демонтируем опору с ее подшипником, снимаем верхнюю металлическую чашку и демпфирующий элемент. Пыльник и сама пружина остались.
10. Осматриваем все детали на предмет износа или повреждений.

Тонкости при установке элемента подвески

1. Приступаем к сборке элемента подвески по обратному демонтажному процессу алгоритма.
2. Рекомендуем проверить амортизатор перед непосредственной установкой. Для этого вам нужно полностью прижать стебель и отслеживать его поведение. Если усилие прижима велико, шток впоследствии медленно (без задержки) возвращается в выдвинутое положение.
   Это указывает на исправность элемента.
3. Специальная отметка, которую производитель любезно нанес на поверхности изделия, поможет правильно установить передние стойки. Направление знака должно быть ориентировано по курсу автомобиля Lada Granta.
4. Достигнув правильного расположения меток, смело собирайте амортизатор, соблюдая всем известную последовательность действий.

Подвести итог

Теперь вы знаете, какие стойки лучше всего разместить. Замена амортизационной стойки, а также ее разборка с целью замены конкретных деталей, не были сложной процедурой. Эта работа под силу рядовому владельцу Lada Granta, у которого есть желание и инструмент. После завершения ремонтных работ не забудьте проверить и отрегулировать развал.

Перед тем, как приступить к непосредственной сборке, убедитесь, что все отметки полностью совмещены друг с другом. Также обязательно проверьте углы, под которыми установлены передние колеса Лада Гранта. Если вы убедились в проблеме, выполните выравнивание развала для более надежной работы автомобиля.

Стоит обратить внимание на то, что передние стойки на амортизаторах выполнены телескопическими, и при возникновении необходимости их замены процедуру можно проводить как полностью, так и частично, просто разобрав ее на части., можно рассмотреть пример работы с одной из стоек, ведь вторая снимается совершенно аналогично. Помните, что для подъема транспортного средства лучше всего использовать подъемник, но если у вас его нет, выполняйте задание на ровной поверхности.

Подготовка к работе

Начинайте откручивать гайки только после того, как автомобиль будет закреплен

Перед началом работ автомобиль необходимо поставить на ручной тормоз и сразу после этого закрепить специальные опоры под задними колесами.Найдите стержень стойки и, постоянно поддерживая ее одной рукой, вставьте шестигранный ключ. Теперь начните осторожно ослаблять гайку вторым ключом, продолжая удерживать конструкцию дальше шестигранником.

Найдите тормозной шланг, он находится на кронштейне амортизационной стойки Lada Granta, и начните его выворачивать вместе с прикрепленным к нему держателем. Не забывайте, что при проведении этой работы вам обязательно нужно будет снять тормозные шланги именно с этого держателя. Используя плоскогубцы на пальце рулевого вала, нажмите на фиксирующую часть шплинта и осторожно вытяните его.Только после этого можно гаечным ключом на 17 открутить с него гайку.

Замена подкосов необходима только при обнаружении течи жидкости, Лада имеет потерю способности гасить колебания. Кроме того, в машине мог сильно деформироваться приклад или разрушиться сайлентблок. Не забывайте, что замену стоек нужно производить комплексно, даже если вы уверены, что неисправна только одна из них.

Инструменты, необходимые для работы:

Снятие стойки Гранта

Если в процессе ремонта стойки на Лада Грант вы столкнулись с тем, что на тормозах вашего автомобиля установлена ​​антиблокировочная система, будьте обязательно снимите датчик, отвечающий за частоту, с которой они вращаются.Затем приступайте к отключению рулевой тяги. Эта процедура должна выполняться одновременно со снятием наконечника поворотного рычага подкоса.

Во избежание существенного нарушения углов установки колес Жигулей в процессе работы обязательно отметьте, где именно находится самый высокий болт и такая же шайба. Всю процедуру можно провести обычным маркером. Это действие поможет вам в дальнейшем добиться правильного положения болта относительно стоек, чтобы Жигули не начинали смещаться в сторону при движении.

Гайки крепления подкосов необходимо откручивать осторожно, не допуская их падения.

Открутите гайку с болта крепления стойки Lada Granta непосредственно к поворотному кулаку. После того, как вы закончите эту процедуру, начните снимать его таким образом, чтобы он одновременно захватил и эксцентриковую шайбу. Теперь открутите гайку крепления нижней стойки амортизатора. Он расположен в непосредственной близости от поворотного кулака. Как только вы отсоедините крепление, снимите болт. Отсоедините поворотный кулак от рейки.

Далее заглянем под капот. Перед вашими глазами три гайки, которые крепят опору к телу. Откручивать их нужно последовательно и осторожно, придерживая подставку, чтобы она ни при каких условиях не упала. Все работы производятся гаечным ключом на 13. Открутив гайки, вытаскиваем подставку.

Берем пружинные стяжки и устанавливаем их на пружину, всегда напротив друг друга. После этого равномерно закручиваем стяжные винты, пока пружина не начнет болтаться.Когда он перестанет давить на опорные чашки, с помощью гаечного ключа на 22 открутите гайки штока. Когда гайки откручены, саму стойку можно будет разобрать. Вынимаем опору стойки вместе с подшипником, снимаем металлическую чашку и демпфер. Остается пружина и пыльник с отбойником.

Установка стойки на автомобиль

Когда вы выполнили все необходимые шаги, снова установите все детали в обратном порядке. Выполняя эту процедуру, следите за положением верхней стойки.

На нем нарисована специальная стрелка, которую после выполнения всех необходимых действий следует направить в сторону будущего движения автомобиля.

Вытяните и несколько раз протолкните шток рукой, чтобы убедиться, что амортизаторы полностью исправны, а в случае неисправности замените и его.

Перед этим убедитесь, что все метки полностью совмещены друг с другом. Также обязательно проверьте углы, под которыми установлены передние колеса.Если вы убедились в проблеме, выполните выравнивание развала для более надежной работы автомобиля.

Передние стойки начали стучать с лета. Езжу в деревню в сотне километров от города. И дороги там, как гладильная доска, а иногда и ямы глубиной как колесо. И часто в поездках начинала стучать. Летом было не так слышно, теперь громче.

Машину оставил зимой в сервисном центре, но через месяц она тоже начала шуметь, плюс стук возобновился.

1. Что мне делать?
2. А как это прискорбно для машины?

Ответ эксперта

Следующие две вкладки изменяют содержимое ниже.

Эксперт по автомобилям Lada с многолетним опытом. У меня есть машина Лада Грант, собираю корч на базе Приора. Иногда ночу в гараже. Моя жена больше ревнует к машинам, чем к женщинам.

Скрипы и стуки могут возникать по разным причинам, и совсем не обязательно, чтобы это была именно стойка.

Lada Grant «проще пропаренной репы», но это не значит, что она плохая, наоборот, это как раз тот случай, когда простота — это хорошо!

Что делать

По поводу вопроса, что с этим делать. Самый простой и, на мой взгляд, самый правильный вариант — обратиться в специализированный сервис. Желательно не тот, в котором вам диагностировали машину в последний раз. Если стук прошел, а потом появился снова, то можно было заменить деталь на некачественную (бывшую в употреблении), возможно, с прибылью.А может случилась авария и запчасть оказалась некачественной.

Диагностика элементов передней подвески в сервисном центре

Помимо диагностики стойки (амортизатора) в сервисном центре проверит и остальные элементы подвески, такие как шаровые, «крабы» и стойки стабилизатора.

Каким плачевным это может быть

Работы по диагностике и ремонту передней подвески в автосервисах настолько рутины, что проблем возникнуть не должно.К тому же Lada Granta — очень распространенный автомобиль, а потому его изучили сотрудники ремонтных станций «вдоль и поперек».

Советую не откладывать ремонт, так как это может перерасти в гораздо более серьезные проблемы, не говоря уже о вашей безопасности во время вождения. Вождение автомобиля с неисправной подвеской опасно для жизни!

Стекло треснутое. Хорошо, что не стекло с кузовным номером, иначе проблем с ГИБДД не избежать

При повышенной нагрузке «стекло» на кузове может треснуть, а это кузовной ремонт с покраской, что снизит стоимость вашего автомобиля в случае его продажи на вторичном рынке.Плюс все-таки могут быть сложности с ГИБДД.

Стойка амортизатора — важнейший элемент подвески автомобиля Лада Гранта. Комфортность, управляемость и безопасность машины зависят от состояния агрегата.

Потеря контроля над поведением транспортного средства чревата попаданием в аварийную ситуацию.

Поэтому как только появляются первые симптомы неисправности стойки амортизатора, требуется диагностика и при необходимости замена.

Артикул и ориентировочная цена на передние стойки амортизатора оригинальные

Правая и левая оригинальные стойки переднего амортизатора на Гранте конструктивно различаются. Они не взаимозаменяемы и имеют разные артикульные номера. С левой стороны нанесены узлы с каталожными номерами:

• 21500205;
• 219282
  110;
• 2105402;
• 2105403;

Оригинальные стойки амортизатора правой стороны идут с артикульными номерами:

• 210103010;
• 219282
  010;
• 210103000;

Вне зависимости от того, с какой стороны предполагается сборка, новые оригинальные стойки имеют одинаковую стоимость.Цена колеблется от 6000 до 9000 рублей. Покупая б / у запчасть с разборки авто, хозяину удается сэкономить.

Поддерживаемый узел стоит 1000-2500 руб. Минус такой покупки — невозможность точно определить остаточный ресурс, в результате чего запчасть может выйти из строя практически сразу после установки.

Аналоги стоек переднего амортизатора на Лада Гранда

Учитывая дороговизну оригинальных стоек передних амортизаторов, большинство автовладельцев не желают приобретать собственные автозапчасти.Сторонние производители предоставляют возможность приобрести аналог по более привлекательной цене. Лучшие альтернативы, достойные показать себя на Lada Granta, представлены в таблицах ниже.

Таблица — Хорошие аналоги левой передней стойки оригинального амортизатора

Таблица — Лучшие альтернативы штатной передней правой стойке сторонних производителей

Номер артикула и примерная стоимость оригинальных стоек заднего амортизатора Lada Granta

В отличие от переднего моста, задние амортизаторы с правой и левой стороны одинаковы.Они полностью взаимозаменяемы и имеют артикул 211500400. Стоимость нового агрегата 2-4 тысячи рублей.

Кроме нового оригинального стеллажа, есть возможность купить свою запчасть на автосалонах. Такой узел имеет стоимость 500 руб. Неуверенность в отношении оставшегося срока службы заставила многих автовладельцев отказаться от покупки бывших в употреблении стоек.

Артикул и стоимость хороших аналогов

На рынке есть аналоги родных стоек амортизаторов Гранта.Сторонние производители выпускают сборки самого разного качества.

Некоторые из них откровенно неполноценного брака, но есть и вполне достойные экземпляры. В таблице ниже представлены бренды лучших аналогов, которые отлично себя зарекомендовали на Гранте.

Предварительная подготовка к замене

При замене стоек амортизатора может потребоваться дополнительная покупка сопутствующих товаров. Чаще всего возникает необходимость в установке новых резиновых изделий, таких как пылезащитные колпачки, бамперы и изолирующие уплотнители.В некоторых случаях необходимо сначала купить пружины и крепеж.

Необходимые инструменты для самостоятельной замены

Для того, чтобы замена стойки переднего амортизатора своими руками на Гранту прошла успешно, рекомендуется заранее подготовить следующий перечень инструментов.

Стол — Инструменты, необходимые для замены передней стойки

Замена стоек переднего амортизатора на Лада Гранта

Пошаговая инструкция по замене стоек переднего амортизатора на Гранте дана ниже.

• Открыть капот.
• Ослабьте гайку крепления штока, удерживая ее от проворачивания вторым ключом.

• Фикс Гранта с ручником.
• Подложить противооткатные упоры под заднюю ось.
• Поднимите автомобиль и снимите колесо.

• Отсоединить тормозной шланг.
• Обильно опрыскать все резьбовые соединения проникающей смазкой.

• Вытащить шплинт плоскогубцами.
• Снимите гайку штифта рулевого наконечника.

• Освободите штифт из поворотного рычага. Для этого рекомендуется использовать съемник, но в крайнем случае можно обойтись монтировкой и молотком.

• Снимите две гайки крепления стойки амортизатора к поворотному кулаку.

• Выбить болты из сиденья.

• Отсоедините стойку.
• Снимите три гайки, которыми верхняя опора крепится к стеклу кузова.

• Снимите собранный модуль.

• Ослабьте пружину с помощью кабельных стяжек.

• Полностью отвинтите гайку штока.

• Провести поиск неисправностей.
• Заменить неисправные элементы и собрать все в обратной последовательности.

• После установки новой стойки на Гранту в обязательном порядке необходимо проверить и откорректировать углы установки колес на стойке.

Список инструментов, необходимых для замены

Для замены стоек С требуются следующие инструменты.

Таблица — Инструменты, необходимые для замены задней стойки

Пошаговая замена стоек заднего амортизатора на Лада Гранта

Замена стойки заднего амортизатора выполняется согласно инструкции ниже.

1. Сложите спинку заднего сиденья.
2. Подденьте резиновую заглушку отверткой.
3. Снять кожух, закрывающий гайку стойки амортизатора заднего амортизатора.
4. Отверните гайку крепления верхней стойки.
5. Включить переднюю передачу.
6. Наденьте обувь.
7. Поднимите заднюю часть Гранты и снимите колесо.
8. Отверните гайку болта крепления нижней стойки амортизатора.
9. Снимите болт.
10. Отсоедините нижний конец стойки C от кронштейна.
11. Снимите пружину.
12. Снимите втулку и нижнюю подушку.
13. Снимите пыльник.
14. Снимите отбойник.
15. При необходимости заменить изолирующую прокладку пружины.
16. Установите пружину на стойку.
17. Собрать все в обратном порядке. При этом следует учитывать, что нижний конец пружины должен быть направлен в сторону колеса.
18. Проверить работу подвески.

Lada Granta — один из самых дешевых и доступных автомобилей на российском рынке. Автомобиль построен на общей платформе с Kalina и имеет схожие технические характеристики.Однако что касается подвески, то Lada Granta была немного изменена. О том, как устроено шасси и в чем его неисправности — далее в нашей статье.

Назначение

Любая подвеска является неотъемлемой частью ходовой части автомобиля. Его основное предназначение — обеспечить эластичное соединение между корпусом и колесами за счет гашения колебаний. В автомобиле Lada Granta подвеска немного отличается спереди и сзади. Поэтому ниже мы подробно рассмотрим каждый элемент.

Передняя подвеска «Лада Грантс»

Имеется независимая подвеска с поперечными рычагами и стабилизатором поперечной устойчивости. Гашение вибрации осуществляется гидравлическими амортизаторами. Основным конструктивным элементом является стеллаж. В его состав входят поворотный подшипник, амортизатор и пружина. В последнем используются витки переменного диаметра. Сама пружина сделана из круглого металлического стержня. Может иметь переменную и постоянную жесткость.

Передняя подвеска «Лада Гранты» устроена таким образом, что на нее опирается нижняя часть стойки.При вращении колес вместе с ними вращаются пружина и амортизатор. Сама подставка остается неподвижной. Таким образом инженеры добились увеличения срока службы упругого элемента при сохранении впускного отверстия в корпусе амортизатора.

Также была улучшена поддержка стоек. Скрип подвески на Лада Грантс появляется гораздо реже, чем на Калине и Приоре. Для уменьшения крена в конструкции предусмотрен стабилизатор поперечной устойчивости. Он состоит из стабилизатора поперечной устойчивости, прикрепленного концами к нижним рычагам подвески.Его средняя часть крепится к корпусу.

Что еще изменилось в подвеске Гранты?

Угол поворота руля увеличен. Угол кастера теперь составляет 2 ° 45 ‘. Этот ход значительно повысил курсовую устойчивость автомобиля на высоких скоростях. Однако руль при этом стал «тяжелее». Особенно это заметно на моделях без электроусилителя. Кстати, в рулевом используется короткая рейка.

Задняя подвеска

В отличие от передней практически не претерпела изменений.Здесь, как и в первых советских «восьмерках», используется полунезависимая балка. Крепится к корпусу на петлях («крабов» в конструкции, к счастью, нет). В качестве упругого элемента используется винтовая пружина постоянной жесткости. Два амортизатора используются для гашения колебаний и предотвращения раскачивания.

Масляные элементы поставляются с завода. Пружина закреплена вместе с амортизатором. Это значительно упрощает работы по техническому обслуживанию, но отрицательно сказывается на обращении.Часто задняя ось буксует при поворотах. Но, несмотря на архаичный дизайн, владельцы отзываются об этой подвеске положительно и выделяют ряд достоинств:

• Высокая надежность. В конструкции отсутствуют дополнительные рычаги, которые к тому же могут погнуться при падении в большую яму.
• Энергоемкость. «Лада Гранта» отлично проглатывает все неровности, особенно если сзади установлены масляные амортизаторы.
• Низкая стоимость обслуживания. За счет простой конструкции эту подвеску можно «накинуть» даже своими руками.А стоимость новых резинометаллических элементов вряд ли опустошит карманы даже самого скупого автовладельца.

Главное отличие «грантовой» подвески

У них положительный развал — около 0,1 °). На Приоре, например, этот показатель -1 градус. Далее мы рассмотрим основные неисправности шасси на «Ладе Грант».

Амортизатор

Этот элемент является гасящим устройством. Амортизатор используется для уменьшения диапазона вибрации кузова автомобиля.Другими словами, элемент предотвращает самопроизвольное раскачивание. Амортизатор основан на гидравлическом сопротивлении. Внутри него находится жидкость определенной вязкости. Он перемещается через специальный клапан. Таким образом, устройство поглощает резкие удары, сохраняя при этом уязвимые детали подвески. Следовательно, амортизатор является одним из наиболее ответственных компонентов шасси. На наших дорогах этот элемент служит прядью 60-80 тысяч километров. Но этот срок может быть короче даже при осторожном стиле вождения.Достаточно просто повредить защитный чехол, и вся грязь скопится в уплотнении штока.

Они подвержены наибольшему износу, поскольку имеют гораздо больший ход. При быстрой езде по ямкам может просто закипеть. Это одна из причин выхода из строя амортизатора. Но чаще всего течет — клапан теряет герметичность из-за сильной поломки или удара. В результате внешняя поверхность цилиндра покрывается маслянистой жидкостью. Как определить, что данный элемент вышел из строя? Все очень просто — вы услышите характерный стук в подвеске Lada Grants.Причем в салоне это хорошо видно. Снаружи пробитый амортизатор практически не слышно. Этот стук настолько силен, что даже хорошая музыка не может его прервать. Вы сразу услышите проколотый амортизатор.

Также обратите внимание, что демпфирующий элемент меняется попарно. То есть при поломке заднего левого амортизатора меняется и задний правый. Что касается передних стоек, то они более «живучие». Часто меняют уже в сборе с пружиной, так как выходят из строя не раньше, чем через 150-200 тысяч километров.

Сайлентблоки

К 100 тысячам выходят из строя сайлентблоки поперечины и нижних рычагов. Признаки неисправности — глухой стук передней подвески Лады Грантс. Автомобилисты рекомендуют менять эти элементы на полиуретановые.

Отличаются более высокой прочностью и хорошим ресурсом. На заводе установлены резиновые втулки, которые не выдерживают ударов наших дорог. Для замены нам нужно выдавить старый элемент. Сначала от него срезается бусинка, а затем при помощи оправки или стамески выбивается.Запрессовка производится тисками. Важно сохранить выравнивание и не перепутать сторону установки. Для облегчения монтажа рекомендуется использовать смазку.

Выходят из строя и сайлентблоки стабилизатора поперечной устойчивости. Эти втулки тоже меняют на полиуретановые.

Шаровые опоры

Эти элементы устанавливаются вверху и внизу рычагов передней подвески. Шарики используются для поворота управляемых колес и их движения в желаемом направлении. В состав детали входят:

• Корпуса.
• Лайнер пластиковый.
• Контрольное отверстие.
• Защитный чехол (пыльник).

Причина неисправности

Основная причина выхода из строя элемента — нарушение герметичности пыльника. Как только он начнет трескаться, внутрь попадет грязь и пыль. Они действуют на мяч как абразив. В результате появляется люфт и опора начинает сама ломаться. Можно ли отремонтировать? Подвеска «Лада Грантс» сконструирована таким образом, что шаровые опоры не подлежат восстановлению и полностью заменяются на новые.

Эти элементы изменяются как набор. Цена двух мячей около 700 рублей. СТО на установку уйдет около 600. Хотя их можно заменить своими руками. Все необходимое: домкрат, яма, набор головок и специальный ключ-звездочка. Но учтите, что болты в этой области могут закиснуть. При замене велик риск зализать края звездочки. Очень осторожно выкручиваем все болты — не давить с силой. Ресурс оригинальных шаровых опор — около 40 тысяч километров.

Подшипник ступицы

Этот элемент служит для равномерного вращения колес автомобиля. Таких подшипников на «Гранте» 4. В среднем их ресурс составляет 100 тысяч километров. Каковы симптомы неисправности? Основная особенность — характерный гул при движении. Он может усилиться, если автомобиль выезжает на поворот. Гул может возникать с любой стороны автомобиля, в зависимости от того, какой подшипник вышел из строя. Его меняют в сборке на новый, причем неважно, задняя подвеска у Лады Грант или передняя.Выдавливается при помощи съемника со специальными лапками. Запрессовка происходит в тисках. При запрессовке важно сохранять соосность. Если подшипник установлен криво, он будет подвергаться высоким нагрузкам и может разрушиться через тысячу километров.

Главный враг подшипника — это влага. Поэтому при установке так важно обеспечить герметичность элемента. Некоторые производители закрывают его специальной крышкой (надевается на крепежную гайку), что предотвратит попадание внутрь соли, воды и других реагентов.Но как только пыль попадает в подшипник, подшипник начинает работать за пределами своего температурного диапазона.