OD _{, образец} относится к поглощению лунки с обработанными клетками и CCK-8.OD _blank относится к поглощению лунки со средой и CCK-8, но без клеток. OD _{контроль} относится к поглощению лунки с необработанными клетками и CCK-8. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Biotek Instrument; Gene Co., Ltd., VT, США), и результаты представлены в виде среднего значения ± SD для трех лунок.

Транспортный кабинет

Апикальная (AP) и базолатеральная (BL) стороны типичны для поляризованных эпителиальных клеток Caco-2, MDCK и MDCK-MRP2.Перед экспериментами монослои поляризованных клеток дважды промывали теплым раствором HBSS и затем предварительно инкубировали (37 ° C, 30 мин). После этого раствор HBSS с обеих сторон монослоев клеток удаляли с помощью настольного мини-вакуумного насоса. Для измерения проницаемости от AP к BL (абсорбционный транспорт) 400 мкл HBSS, содержащего гармалин или гармин, добавляли к стороне AP, в то время как 600 мкл холостого HBSS добавляли к стороне BL. Для измерения проницаемости от BL к AP (секретный транспорт) 600 мкл HBSS, содержащего гармалин или гармин, добавляли к стороне BL и 400 мкл холостого HBSS добавляли к стороне AP.Раствор гармалина или гармина был свежеприготовленным в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в HBSS или смеси лекарств была ниже 0,5%. Монослои инкубировали при 37 ° C, и через 30, 60, 90 и 120 минут отбирали образцы по 100 мкл из акцепторного отсека и сразу же заменяли таким же объемом предварительно нагретого свежего холостого образца HBSS. Измерения TEER для оценки целостности мембраны проводились до и после экспериментов.

Транспорт гармалина и гармина оценивали в обоих направлениях при различных концентрациях (1, 2 и 5 мкМ).Влияние pH на транспорт гармалина или гармина в обоих направлениях изучали с использованием следующих значений pH в акцепторном или донорском отделении: 5,5 / 5,5 и 7,4 / 7,4. Перенос гармалина или гармина при 4 и 37 ° C в обоих направлениях был оценен для исследования температурного эффекта. Для выявления параклеточного транспорта гармалина или гармина клеточный монослой предварительно инкубировали с 5 мМ EDTA в HBSS без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ в течение 30 минут. Затем гармалин или гармин с 5 мМ EDTA в HBSS без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ добавляли в отсек AP или BL.

Эксперименты по транспортной специфичности проводили путем тестирования ингибирования транспорта селективными ингибиторами или субстратами выбранных переносчиков. Чтобы изучить роль переносчиков притока и оттока в транспорте гармалина или гармина, 50 мкМ ванадата натрия (Na ⁺ / K ⁺ -АТФаза), 10 мМ NaN ₃ (аденозинтрифосфат, АТФ), 50 мкМ циметидин ( ОАТ), 50 мкМ ES (OATP), 5 мМ TEA (OCT / OCTN), 0,3 мМ флоретин (MCT), 0,5 мМ флоридзин (SGLT1), 10 мМ Gly-Sar (PEPT1), 100 мкМ верапамил и хинидин (MDR1) 50 мкМ MK571 и 200 мкМ пробенецида (MRP2), 10 мкМ Ko143 и 25 мкМ апигенина (BCRP) добавляли как на AP, так и на BL стороны монослоев.После 30 мин предварительной инкубации эти соединения с гармалином или гармином (2 мкМ) добавляли либо к стороне AP, либо к стороне BL, а пустой буфер HBSS добавляли к другой стороне, соответственно. В качестве контроля в каждом эксперименте по ингибированию также оценивали транспорт гармалина или гармина в отсутствие какого-либо ингибитора или субстрата.

Коэффициенты кажущейся проницаемости ( P _app ) и ER были рассчитаны по уравнениям (2) и (3):

, где dQ / dt — стационарный поток, A — площадь поверхности мембраны, а C ₀ — начальная концентрация лекарственного средства в донорском отделении. P _appBA — это P _app — значение, измеренное в направлении от BL к AP, и P _appAB — это P _app в направлении BL. Это указывает на участие активного транспортного процесса, когда значение ER- выше 1,5 (Hubatsch et al., 2007).

Везикулярный транспорт

Анализ везикулярного транспорта осуществляли, как описано в протоколе набора для везикулярного транспорта GenoMembrane ™ (GenoMembrane, Канагава, Япония) с небольшими изменениями.Вкратце, исходные везикулы размораживали и разбавляли буфером для анализа (50 мМ MOPS-Tris, 70 мМ KCl и 7,5 мМ MgCl ₂ ). Десять микролитров гармалина или гармина в концентрации 1 или 10 мкМ смешивали с 5 мкл буфера для анализа и 20 мкл 10 мМ раствора MgATP; 10 мкл везикулы смешивали с 5 мкл буфера для анализа; после 5-минутной предварительной инкубации две смеси затем смешивали и инкубировали еще 5 минут. MgAMP вместо MgATP использовали в качестве контроля. Помимо этого, 4 мМ глутатиона также был включен в анализы BCRP и MRP2.Транспортировку прекращали ледяным буфером для анализа, а затем образцы быстро переносили на фильтровальный планшет. Лунки немедленно промывали 5 раз 200 мкл буфера для анализа и сушили. Везикулы на планшете растворяли в 50 мкл 80% метанола и центрифугировали при 2000 об / мин в течение 2 минут после сбора и повторения описанных выше процедур. Смешали два фильтрата и добавили предварительно охлажденный метанол. После центрифугирования при 12000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C аликвоту надосадочной жидкости объемом 5 мкл вводили в систему UPLC-ESI-MS / MS для анализа.Кроме того, поглощение NMQ (MDR1), LY (BCRP) и E ₂ 17βG (MRP2) использовали для оценки активности конкретных везикул.

Вестерн-блоттинг

Клетки Caco-2 высевали в 6-луночные планшеты при плотности 1 × 10 ⁵ клеток / мл и культивировали в течение 24 часов. После обработки гармалином или гармином в течение 48 ч с их концентрациями 1, 2 и 5 мкМ клетки промывали 3 раза ледяным PBS и лизировали на льду буфером для лизиса RIPA, содержащим ингибитор протеаз и ингибитор фосфатазы.Лизат белка собирали центрифугированием при 12000 об / мин при 4 ° C в течение 10 минут и определяли общее содержание белка с помощью набора для анализа белков BCA. Затем белки смешивали с четвертью объема загрузочного буфера и нагревали при 100 ° C в течение 5 минут. Приблизительно 20 мкг общего содержания белка разделяли с помощью SDS-PAGE через 8% акриламидный гель и переносили на мембраны из ПВДФ. После промывания PBST мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в PBST в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), а затем инкубировали с анти-MRP2 (1: 500) и анти-GAPDH (1: 5 000) в течение ночи при температуре окружающей среды. 4 ° С.После этого мембраны промывали PBST и инкубировали с конъюгированным с HRP вторичным антителом против кролика (1: 5000) в течение 2 часов при комнатной температуре. После полной промывки PBST полосы белка визуализировали с помощью набора ECL prime (GE Healthcare, NA, UK).

Анализ наркотиков

Процедура экстракции

Для приготовления транспортных и последующих образцов плазмы использовался удобный и быстрый метод осаждения. В аликвоту образца 100 мкл добавляли 400 мкл ацетонитрила, содержащего IS в 1.Центрифужная пробирка на 5 мл, а затем перемешивание на вортексе в течение 1,0 мин; затем смесь центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C. До 400 мкл супернатанта переносили в другую чистую пробирку и упаривали досуха при 37 ° C в слабом потоке азота. Высушенный остаток восстанавливали 80 мкл 9% ацетонитрила и встряхивали в течение 1,0 мин. После центрифугирования при 12000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C аликвоту надосадочной жидкости объемом 5 мкл вводили в систему UPLC-ESI-MS / MS для анализа.

Анализ UPLC-ESI-MS / MS

Концентрации гармалина и гармина количественно определяли одновременно с помощью системы Waters-ACQUITY ™ UPLC (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США) с использованием колонки ACQUITY UPLC BEH C ₁₈ (50 × 2,1 мм, размер частиц 1,7 мкм). Масс-спектрометрическое детектирование проводили с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США), оборудованного электрораспылением ионизации в режиме положительной ионизации, а все остальные инструментальные параметры были установлены в соответствии с нашим предыдущим исследованием (Li et al., 2016 ). Метод UPLC-ESI-MS / MS был хорошо проверен (данные не показаны), и аналитический метод был успешно применен для определения концентрации гармина и гармалина в буферах HBSS.На рисунке S2 представлены типичные MRM-хроматограммы холостого HBSS, холостого HBSS с добавлением гармина, гармалина и IS, а также образца HBSS с добавлением IS, собранных через 30 мин после введения гармина и гармалина.

Метаболическая стабильность гармалина и гармина в микросомах печени человека

Гармалин или гармин (2 мкМ) инкубировали с микросомами печени человека (0,5 мг белка / мл) в течение 0, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90 минут, используя наш предыдущий метод (Li et al., 2016) . Остаточный процент гармалина или гармина наносили на график в зависимости от времени инкубации.Период полувыведения ( T _1/2 ) гармалина или гармина рассчитывали с помощью регрессионного анализа полулогарифмических графиков. Внутренний клиренс ( CL _int ) гармалина или гармина оценивался в соответствии с уравнением (4) из in vitro T _1/2 , инкубационного объема ( V ) и массы микросомальных белков в инкубационной смеси ( P ) (Liu et al., 2010).

Фармакокинетика

Утвержденный метод был применен к фармакокинетическому исследованию гармалина и гармина на крысах после однократного внутривенного и внутрижелудочного введения гармалина, гармина или гармина совместно с пробенецидом. Сорок крыс с 20 самцами и 20 самками были случайным образом разделены на пять групп по восемь крыс в каждой. Хармалин или гармин вводили восьми крысам через зонд в дозе 40,0 мг / кг, а восьми крысам вводили через хвостовую вену в дозе 3.3 мг / кг, растворенного в физиологическом растворе с бактерицидной обработкой; восьми другим крысам перорально вводили смесь гармина (40,0 мг / кг) и пробенецида (20,0 мг / кг). Примерно 0,25 мл образца крови собирали из угловой вены каждой находящейся в сознании крысы и переносили в гепаринизированные пробирки через 0 (перед дозой), 0,03, 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 12,0 и 24,0 ч. после администрации. Крысы имели свободный доступ к воде после 4,0 ч взятия пробы крови.Серийные образцы крови немедленно центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 минут, и 100 мкл слоя надосадочной плазмы переносили в другую новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и хранили при -80 ° C до анализа.

Концентрации гармалина и гармина в плазме рассчитывались непосредственно по их калибровочным кривым соответственно. Были построены кривые зависимости концентрации в плазме от времени и все фармакокинетические параметры гармалина и гармина, такие как константа скорости абсорбции ( K _a ), константа скорости распределения ( K _d ), константа скорости выведения ( K _e ), период полувыведения ( T _{1 / 2a} ), период полураспада ( T _{1 / 2d} ), период полувыведения -жизнь ( T _{1 / 2e} ), кажущийся объем распределения ( V _d ), скорость клиренса ( CL ), площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от нуля до времени t ( AUC _{0− t} ), площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от нуля до бесконечности ( AUC _{0 — ∞} ) и среднее время пребывания ( MRT ) были обработано с использованием некоммерческой Программа для анализа внутренних фармакокинетических данных раствора PK 2.0 ™ (Summit Research Services, США). Максимальная пиковая концентрация ( C _max ) и время достижения максимальной концентрации в плазме ( T _max ) были получены непосредственно из данных наблюдаемой концентрации в зависимости от времени. Значение F для гармалина или гармина рассчитывали по соотношениям нормализованных по дозе AUC _{0 — ∞} после перорального и внутривенного введения по следующему уравнению (5):

Экскреция у крыс

Шестнадцать крыс, восемь самцов и восемь самок были помещены в метаболические клетки по отдельности и затем голоданы в течение ночи до 2 часов после перорального введения гармалина и гармина в дозе 40.0 мг / кг. Доступ к воде поддерживался постоянно. Образцы, включая холостую мочу и кал перед дозированием, мочу и фекалии от 0 до 24 часов, от 24 до 48 часов и от 48 до 72 часов после дозирования, собирали и хранили при -80 ° C до анализа.

Образцы мочи оттаивали и аликвоту 100 мкл обрабатывали для обнаружения, как описано в разделе «Анализ лекарственных средств». Кал гомогенизировали, а затем взвешивали, добавляли 6-кратный ацетонитрил, экстрагировали ультразвуковой волной в течение 1 ч и затем центрифугировали. Аликвоту 100 мкл также обрабатывали для обнаружения, как описано в разделе «Анализ лекарственных средств».

Анализ данных

Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения SPSS версии 17.0, и данные были выражены как среднее значение ± SD . Для сравнения двух групп использовался двусторонний непарный тест Стьюдента t . Статистически значимыми считались P <0,05, P <0,01 и P <0,001.

Результаты

Анализ цитотоксичности

Гармалин и гармин были протестированы с помощью анализа CCK-8 на возможные цитотоксические эффекты в клеточных линиях Caco-2 и MDCK.Более 90% клеток Caco-2 и MDCK были жизнеспособными при использовании во время экспериментов до 25 мкМ для гармалина или 5 мкМ для гармина (рис. S3). Согласно этим результатам было подтверждено, что ни один из гармалина и гармина в испытанных концентрациях (1, 2 и 5 мкМ) не проявлял токсичности или снижения жизнеспособности клеток.

Транспортный кабинет

Характеристики транспортировки

Трансклеточный транспорт гармалина и гармина через монослои клеток Caco-2 и MDCK исследовали как время, концентрацию, pH, изменение температуры и роль параклеточного пути.

Эффект времени и концентрации

Всего три концентрации (1, 2 и 5 мкМ) были использованы для исследования транспорта гармалина и гармина через монослои клеток Caco-2 и MDCK при 37 ° C с временем инкубации от 0 до 120 мин на AP или Сторона BL. Не наблюдалось явного изменения значения TEER среди групп концентрации гармалина и гармина во время 2-часового экспериментального воздействия, что свидетельствует о целостности клеточных монослоев. Как показано на рисунке 1, перенос гармалина и гармина в обоих направлениях постепенно увеличивался со временем и концентрацией.Интересно, что кумулятивные транспортные потоки гармина среди групп концентрации были намного выше в направлении от BL к AP, чем в направлении от AP к BL. P _app и ER — значения гармалина и гармина в обоих направлениях суммированы в таблице 1. С увеличением концентрации P _app — значения гармалина и гармина увеличивались в в обоих направлениях. В направлении от AP к BL проницаемость для гармалина и гармина была ниже, чем у пропранолола, маркера трансцеллюлярного потока с P _appAB -значением (41.90 ± 3.30) × 10 ⁻⁶ см / с (Shen et al., 2015). Значения ER гармалина были <1,5 при испытанных концентрациях, и можно подтвердить, что гармалин переносился в основном путем пассивной диффузии. Однако перенос BL в AP-гармин был в 1,5–1,6 раза выше, чем перенос в противоположном направлении. Все значения ER при различных концентрациях были> 1,5, что свидетельствует о вовлечении в процесс активного транспорта (Hubatsch et al., 2007). Гармин может быть субстратом для переносчиков оттока, таких как MDR1, BCRP и MRP2, которые могут участвовать в процессе оттока, что приводит к более низким концентрациям гармина в рецепторном отделении.

Рисунок 1 . Кумулятивные транспортные потоки гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 (A) и MDCK (B) в обоих направлениях (AP в BL и BL в AP) в разное время и в разных концентрациях. Здесь направление от AP к BL (абсорбционный транспорт): гармалин или гармин добавляли к стороне AP, и образцы собирали со стороны BL; направление от BL к AP (секретный транспорт): гармалин или гармин добавляли к стороне BL и образцы собирали со стороны AP.Данные представляют собой среднее значение ± SD для трех повторов.

Таблица 1 . Двунаправленные P _app -значения гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 и MDCK (среднее ± SD, n = 3).

Влияние pH

Определяли влияние pH на двунаправленный транспорт гармалина и гармина (2 мкМ) в двух монослоях клеток. Как показано на рисунке 2, совокупные транспортные потоки гармалина и гармина при pH 5.5 были намного ниже, чем при pH 7,4 в обоих направлениях. P _app — значения гармалина и гармина в двух направлениях перечислены в таблице 2. P _appAB — значения гармалина и гармина при pH 7,4 были значительно выше (3,65 и 3,56). раз), чем при pH 5,5 ( P <0,001) по монослоям клеток Caco-2, и которые также были явно выше (в 1,56 и 2,05 раза), чем при pH 5,5 ( P <0.05) через монослои клеток MDCK. Следовательно, данные показали, что транспорт гармалина и гармина зависит от pH, что может быть связано с физико-химическими свойствами лекарств.

Рисунок 2 . Кумулятивные транспортные потоки гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 (A) и MDCK (B) в обоих направлениях (от AP к BL и от BL к AP) при различных условиях (pH 7,4 или 5,5, 37 или 4 ° C, с ЭДТА или без нее). Данные представляют собой среднее значение ± SD для трех повторов.

Таблица 2 . Двунаправленные P _app -значения гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 и MDCK при различных условиях (pH 7,4 или 5,5, 37 или 4 ° C, с или без EDTA; среднее ± SD, n = 3).

Влияние температуры

Как показано на рисунке 2, транспорт гармалина и гармина через монослои клеток Caco-2 при концентрации 2 мкМ был заметно снижен, поскольку P _appAB был изменен с (27.72 ± 1,06) × 10 ⁻⁶ см / с до (7,59 ± 0,33) × 10 ⁻⁶ см / с для гармалина и от (18,78 ± 1,26) × 10 ⁻⁶ см / с до (1,58 ± 0,57) × 10 ⁻⁶ см / с для гармина при понижении температуры от 37 до 4 ° C ( P <0,001). Одновременно с этим, транспорт гармалина и гармина через монослои клеток MDCK также, очевидно, был снижен, значения P _appAB для гармалина и гармина при 37 ° C были значительно выше (3.В 77 и 2,49 раза), чем при 4 ° C ( P <0,001; Таблица 2), то же самое произошло в противоположном направлении. Уменьшение P _appAB и P _appBA при 4 ° C может указывать на то, что транспорт является энергетически зависимым, поскольку снижение температуры замедляет клеточный метаболизм (Duan et al., 2014). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить энергетическую зависимость клеток Caco-2 и MDCK, поскольку снижение температуры также может замедлять пассивную диффузию.

Эффект ЭДТА

Чтобы исследовать потенциальную проницаемость параклеток для гармалина и гармина, EDTA (5 мМ) использовали для временного открытия функционального барьера TJ. Клеточный TJ был модифицирован EDTA для удаления ионов Ca ²⁺ из среды посредством хелатирования. Значения TEER снизились, указывая на то, что соединения клеток открылись, а значения TEER были ниже 100 Ом · см ² после обработки ЭДТА. В таблице 2 перечислены P _appAB — значения гармалина и гармина в обоих направлениях через монослои Caco-2 и MDCK с предварительной обработкой EDTA или без нее.Открывая эти соединения, P _appAB и P _appBA -значения гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 были увеличены ( P <0,05; Таблица 2). После воздействия на монослои клеток MDCK 5 мМ ЭДТА с обеих сторон транспорт гармалина и гармина также увеличился, поскольку P _appAB изменилось с (20,36 ± 1,82) × 10 ^-6 на (29,43 ± 1.45) × 10 ⁻⁶ см / с для гармалина и от (4,60 ± 0,25) × 10 ⁻⁶ до (7,47 ± 1,31) × 10 ⁻⁶ см / с для гармина ( P <0,05) , а P _appBA был увеличен с (21,03 ± 2,11) × 10 ⁻⁶ до (26,34 ± 0,93) × 10 ⁻⁶ см / с для гармалина ( P <0,05) и от (7,32 ± 0,19) × 10 ⁻⁶ до (8,98 ± 0,90) × 10 ⁻⁶ см / с для гармина (таблица 2). Интересно, что значительное увеличение потока гармалина наблюдалось, когда двунаправленный эксперимент проводился в присутствии EDTA, в то время как для гармина, который в основном увеличивался в направлении от AP к BL (таблица 2).Это указывает на параклеточную пассивную диффузию как основной путь проницаемости тестируемых препаратов (особенно для гармалина) через клеточные монослои (Zhang et al., 2014). Кроме того, P _appBA гармина оставалось почти постоянным независимо от присутствия или отсутствия EDTA, предполагая, что гармин проникает в монослои клеток Caco-2 и MDCK через трансклеточный путь в направлении от AP к BL.

Эффекты переносчиков притока

Интересно, что большинство значений P _appAB в направлении от AP к BL показали статистическую разницу по сравнению с контролем, но не было обнаружено значительных различий в направлении от BL к AP в экспериментах с ингибиторами или субстратами. .Таким образом, результаты были сосредоточены на эффектах ингибиторов или субстратов на транспорт гармалина и гармина в направлении от AP к BL в двух монослоях клеток.

На рисунке 3 и в таблицах 3, 4 представлены данные транспортных экспериментов с использованием различных селективных ингибиторов переносчиков притока или субстратов. В исследованиях механизма притока гармалина и гармина использовались циметидин и ES (ингибиторы ОАТ и ОАТФ соответственно) с обеих сторон. Как показано на рисунке 3 и в таблице 3, после добавления циметидина не произошло значительного уменьшения количества переносимого гармалина и гармина в каждой точке отбора проб, а также P _app и ER ( P > 0.05) во время эксперимента, что означает, что ОАТ не вызывали приток гармалина и гармина. Однако абсорбция гармалина и гармина значительно снижалась при добавлении 50 мкМ (фиг. 3, P <0,01) ES на стороне AP; P _appAB уменьшилось с (27,48 ± 0,18) × 10 ⁻⁶ до (24,33 ± 0,49) × 10 ⁻⁶ см / с для гармалина ( P <0,01) и с (18,52 ± 2,06) × 10 ⁻⁶ до (14,64 ± 1,31) × 10 ⁻⁶ см / с для гармина ( P <0.05), соответственно, тогда как ER увеличился с 0,95 до 1,12 для гармалина и с 1,59 до 1,94 для гармина (таблица 3). Следовательно, гармалин и гармин могут транспортироваться в клетки Caco-2 через OATP. Более того, TEA является субстратом OCT / OCTNs, который также ведет себя как ингибитор, и он также ингибирует абсорбцию гармалина и гармина, и проницаемость в направлении от AP к BL была явно снижена (рисунок 3 и таблица 3, P <0,01) , а ER было увеличено с 0.От 95 до 1,13 для гармалина и от 1,59 до 1,88 для гармина. Для дальнейшего изучения АТФ-опосредованного транспорта гармалина и гармина с обеих сторон были добавлены различные субстраты или ингибиторы. NaN ₃ (10 мМ, ингибитор АТФ) и ванадат натрия (50 мкМ, АТФаза Na ⁺ / K ⁺ -зависимый ингибитор) резко снижают транспорт гармалина и гармина и проницаемость AP для BL. направление явно уменьшилось (Рисунок 3 и Таблица 3, P <0.01), а ER был увеличен. Для исследования участия MCT, SGLT1 и PEPT1 использовались модельные ингибиторы флоретин, флоридзин и глицилсаркозин соответственно. Однако 0,3 мМ флоретина, 0,5 мМ флоридзина и 10 мМ глицилсаркозина — концентрация, достаточная для ингибирования МСТ, SGLT1 и PEPT1, не влияла на транспорт гармалина и гармина (таблица 3). Для монослоев MDCK были получены аналогичные результаты, за исключением OATPs (Table 4), что может быть связано с довольно низкой экспрессией OATPs в клетках MDCK (Volpe, 2011).Таким образом, гармалин и гармин могут быть субстратом OATPs и переносчиков притока OCTs / OCTNs.

Рисунок 3 . Кумулятивные транспортные потоки гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 (A, B) и MDCK (C, D) в направлении от AP к BL с различными селективными ингибиторами или субстратами переносчиков притока. Данные представляют собой среднее значение ± SD для трех повторов.

Таблица 3 . Ингибирующие эффекты на двунаправленный транспорт гармалина и гармина в монослоях клеток Caco-2 (среднее ± SD, n = 3).

Таблица 4 . Ингибирующее действие на двунаправленный транспорт гармалина и гармина в монослоях клеток MDCK и MDCK-MRP2 (среднее ± SD, n = 3).

Действие переносчиков оттока

Как показано в таблицах 3, 4, результаты исследований транспорта, проведенных с использованием различных селективных ингибиторов или субстратов переносчиков оттока. Верапамил и хинидин (100 мкМ, ингибиторы MDR1) были выбраны потому, что они более селективны в отношении MDR1, чем другие ингибиторы переносчиков оттока.Транспортное количество гармалина и гармина через 120 мин не изменилось (таблицы 3, 4, P > 0,05), что означает, что гармалин и гармин не были субстратом MDR1 в условиях наших экспериментов. В аналогичных экспериментах с верапамилом и хинидином на отток гармалина и гармина не влияли ингибиторы BCRP Ко143 (10 мкМ) и апигенин (25 мкМ). Как показано в таблицах 3, 4, переносимое количество тестируемых лекарств за 120 мин и проницаемость практически не изменились под действием Ко143 и апигенина ( P > 0.05). Это предполагает, что транспортеры MDR1 и BCRP не участвуют в секреции гармалина и гармина.

Однако, когда MK571 (типичный ингибитор MRP2) был добавлен к стороне AP в монослоях клеток Caco-2, P _appAB гармина через 120 минут увеличилось (1,62 раза), а Значение ER уменьшилось с 1,59 до 0,98 (фиг. 4A и таблица 3, P <0,01), что означает, что переносчик MRP2 регулирует секрецию гармина.Этот результат был подтвержден значениями P _appAB и ER , когда отток гармина ингибировался пробенецидом. Пробенецид представляет собой ингибитор MRP2, который заметно увеличивает транспорт гармина от AP к направлению BL с увеличением значения P _appAB (в 1,27 раза; Рисунок 4A и Таблица 3, P <0,05). Однако оба ингибитора MRP2 (MK571 и пробенецид) не влияли на транспорт гармалина, а P _appAB и ER в транспорте гармалина были аналогичны контролю в направлении от AP к BL (таблицы 3, 4, P > 0.05). Следовательно, ингибирующий эффект MK571 и пробенецида подразумевает, что MRP2 в первую очередь ответственен за отток гармина в направлении от AP к BL.

Рисунок 4 . Кумулятивные транспортные потоки гармина в монослоях клеток Caco-2 (A) , MDCK (B) и MDCK-MRP2 (C) в направлении от AP к BL с различными селективными ингибиторами или субстратами переносчиков оттока. Данные представляют собой среднее значение ± SD для трех повторов.

Таким образом, среди трех выбранных ингибиторов транспортера АТФ-связывающей кассеты (ABC) (MDR1, BCRP, MRP2), особенно MRP2, выявлено высокое сродство к гармину во время секреции гармина, поскольку MK571 и пробенецид увеличивают проницаемость гармина в АР для BL направление. Кроме того, те же результаты были подтверждены в других ячейках (MDCK и MDCK-MRP2; Таблица 4 и рисунки 4B, C, P <0,05).

Везикулярный транспорт

Для проверки транспортных свойств коммерческих мембранных везикул Sf9, экспрессирующих MDR1, BCRP и MRP2 человека, три зонда N -метилхинидин (NMQ), желтый люцифер (LY) и бета-глюкуронид эстрадиол-17 (E ₂ 17βG).Как показано на Фигуре 5, коэффициенты поглощения (UR) трех зондов составляли 2,05, 19,66 и 7,71 соответственно, что указывает на то, что мембранные везикулы могут быть использованы в дальнейших исследованиях (все значения UR были выше 2,00). Он также показал, что значения UR гармалина при 1 и 10 мкМ были <2,00 во всех мембранных везикулах, экспрессирующих MDR1, BCRP и MRP2 человека. В частности, значение UR гармина при 1 мкМ было> 2,65 в мембранных везикулах, экспрессирующих MRP2 человека, что подразумевает, что гармин может быть субстратом MRP2 (рис. 5C).

Рисунок 5 . Коэффициенты поглощения (UR) трех зондов (NMQ, LY, E ₂ 17βG), гармалина и гармина на мембранных везикулах с избыточно экспрессируемыми переносчиками MDR1 (A) , BCRP (B) и MRP2 ( В) . Данные представляют собой среднее значение ± SD для трех повторов.

Вестерн-блоттинг

Экспрессию белка MRP2 в клетках Caco-2, MDCK и MDCK-MRP2 определяли с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на фиг. 6A, MRP2 значительно экспрессируется, слабо экспрессируется и сверхэкспрессируется в клетках Caco-2, MDCK и MDCK-MRP2 соответственно.Кроме того, как видно из рисунка 6B, гармин (2 и 5 мкМ) может слегка повышать экспрессию MRP2 по сравнению с контрольной группой, что указывает на то, что гармин может быть субстратом MRP2 и, вероятно, может ингибировать абсорбцию этих компонентов. опосредовано MRP2. Однако гармалин в тестируемых концентрациях (1, 2 и 5 мкМ) не влиял на экспрессию MRP2, демонстрируя, что MRP2 не отвечает за транспорт гармалина.

Рисунок 6 .Экспрессия белка MRP2 в клетках Caco-2, MDCK и MDCK-MRP2 (A) и эффекты гармалина и гармина (B) . Данные представляют собой среднее значение ± SD из трех повторов * P <0,05; ** P <0,01 (по сравнению с контролем).

Метаболическая стабильность гармалина и гармина в микросомах печени человека

После инкубации гармалина или гармина при 2 мкМ остаточные процентные значения гармалина и гармина составили 64.16 и 54,25% соответственно (рисунок 7). Значение T _1/2 составляло 147,45 мин для гармалина и 99,00 мин для гармина в микросомах печени человека. Значение CL _int составляло 2,8 мл / мин / мг для гармина, что в ~ 1,49 раза больше, чем у гармалина (1,88 мл / мин / мг), что позволяет предположить, что гармалин более стабилен в печени человека. микросомы, чем гармин.

Рисунок 7 . Остаточный процент гармалина и гармина в микросомах печени человека.Данные представляют собой среднее значение ± SD из шести повторов.

Фармакокинетика

Все фармакокинетические параметры гармалина и гармина были получены после перорального и внутривенного введения в дозах 40,0 и 3,3 мг / кг соответственно. На фигуре 8 представлены кривые зависимости средней концентрации гармалина и гармина в плазме от времени после введения крысам. В таблице 5 приведены соответствующие фармакокинетические параметры гармалина и гармина после введения крысам.

Рисунок 8 . Кривые зависимости средней концентрации в плазме от времени гармалина (A) и гармина (B) при внутрижелудочном (40,0 мг / кг) или внутривенном (3,3 мг / кг) введении и совместном введении гармина (40,0 мг / кг) с Ингибитор MRP2 пробенецид (20,0 мг / кг) (C) внутрижелудочно. Данные представляют собой среднее значение ± SD из восьми повторов.

Таблица 5 . Фармакокинетические параметры гармалина и гармина у крыс после внутрижелудочного и внутривенного введения гармалина, гармина и гармина совместно с пробенецидом, ингибитором MRP2 (среднее ± SD, n = 8).

После введения через желудочный зонд , гармалин и гармин могут всасываться в кровоток при коротком T _max 0,56 ± 0,13 ч и низком C _max 67,05 ± 34,29 нг / мл для гармина и относительно длинный T _max 1,76 ± 1,11 ч и высокий C _max 117,80 ± 59,01 нг / мл для гармалина после однократной пероральной дозы 40.0 мг / кг у крыс (рисунок 8 и таблица 5). Кривая зависимости концентрации в плазме от времени для гармалина и гармина вызвала медленную фазу снижения с T _{1 / 2e} , равным 5,13 ± 1,52 часа и 4,73 ± 0,71 часа, соответственно, после дозирования, что показало ту же тенденцию при внутривенном введении. дозировка. Чтобы установить, является ли гармин субстратом MRP2, гармин вводили перорально вместе с пробенецидом (ингибитор MRP2). Как показано на Рисунке 8 и в Таблице 5, C _max , T _max , T _{1 / 2e} , AUC _{(0- t )} , AUC _{(0 − ∞)} , MRT -значения гармина в группе совместного введения пробенецида были значительно выше, чем в группе введения гармина (таблица 5, P <0.05, P <0,01 или P <0,001). Напротив, значения V _d и CL были явно ниже, чем у группы, принимавшей гармин (таблица 5, P <0,01 или P <0,001). Стоит отметить, что значение F гармина увеличивалось в 1,96 раза после совместного введения с пробенецидом, что дополнительно продемонстрировало, что гармин может действовать как субстрат MRP2.

Экскреция у крыс

Суммарное выведение гармалина и гармина с мочой и калом после перорального приема 40.0 мг / кг представлено в таблице 6. Гармалин и гармин в моче крысы обнаруживались с низкой концентрацией в течение 72 часов после перорального приема, в то время как гармалин и гармин не обнаруживались в фекалиях в течение 48–72 часов. Гармалин и гармин плохо выводятся с мочой и калом, и у крыс были обнаружены четыре метаболита гармалина (гармин, гармалол, гармол, M279) и два метаболита гармина (гармол, M279). Кумулятивная экскреция составляла 5,05 ± 4,12% для гармалина и 0,69 ± 0,36% для гармина с мочой и калом в течение 72 часов после внутрижелудочного введения.Учитывая комбинацию интактных препаратов и их метаболитов в моче и кале, было обнаружено около 16,04 ± 5,45% для гармалина и 28,18 ± 8,24% для гармина, что свидетельствует о том, что гармин метаболизируется легче, чем гармалин, у крыс in vivo после перорального приема. Низкая скорость восстановления гармалина и гармина, вероятно, была связана с их преобразованием в другие необнаруженные метаболиты, что требует дальнейшего подтверждения.

Таблица 6 . Кумулятивная экскреция гармалина и гармина с мочой и калом у крыс после перорального приема гармалина и гармина (40.0 мг / кг; среднее ± SD, n = 8).

Обсуждение

Заболевания центральной нервной системы (ЦНС) являются серьезной проблемой для здоровья и часто связаны с инвалидностью или смертью. В последние несколько десятилетий сообщалось, что два аналога гармалин и гармин обладают потенциалом для лечения болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, депрессии и других расстройств ЦНС (Li et al., 2017). Ряд исследователей провели некоторые исследования транспорта, метаболизма, фармакокинетики, фармакологических и токсикологических свойств гармалина и гармина (Li et al., 2017). В 2004 году было обнаружено, что β-карболиновые алкалоиды гармалин, гармин, гармалол, гармол и гарман демонстрируют среднюю или высокую скорость истечения и коэффициенты проницаемости в диапазоне концентраций 250–500 мкМ, а также следуют зависимому от концентрации механизму пассивной диффузии (Khan и др., 2004). Однако, согласно предыдущим исследованиям, эти алкалоиды, особенно гармалин и гармин, показали заметную цитотоксичность и значительно подавляли рост опухолевых клеток с апоптотическим эффектом (Picada et al., 1997; Ламчури и др., 2012; Ли и др., 2017). Следовательно, при изучении транспорта этих алкалоидов необходимо отдавать предпочтение исследованию их цитотоксичности.

В текущем исследовании результаты анализа цитотоксичности подтвердили, что ни один из гармалина (до 25 мкМ) и гармина (до 5 мкМ) не показал токсичности или снижения жизнеспособности клеток в клетках Caco-2 и MDCK. Когда концентрация препарата была выше 100 мкМ для гармалина и 25 мкМ для гармина, это могло вызвать заметную токсичность (рисунок S3).Тем не менее, концентрации алкалоидов находились в диапазоне от 250 до 500 мкМ в исследовании, проведенном Khan et al. (2004), которые намного превышали безопасную дозировку и приводили к повреждению клеток и изменению активности транспортеров или проницаемости монослоев клеток Caco-2 и MDCK и, в конечном итоге, приводили к противоречивому результату в транспортных характеристиках тестируемых препараты по сравнению с безопасной дозировкой. Следовательно, цель этого исследования состояла в том, чтобы прояснить внутренние транспортные характеристики и механизмы гармалина и гармина, двух аналогичных бета-карболиновых алкалоидов, через кишечные монослои клеток Caco-2 и почек собак MDCK в диапазоне нетоксичных концентраций (1, 2 и 5 мкМ).

В настоящем исследовании гармалин и гармин продемонстрировали зависимый от концентрации профиль проницаемости в монослоях клеток Caco-2 и MDCK (рис. 1). Проницаемость гармалина от AP к BL была почти равна проницаемости от BL к AP, что указывает на неполяризованный перенос гармалина. Однако проницаемость гармина от AP к BL была явно ниже, чем проницаемость от BL к AP, что указывает на активный транспорт гармина. Проницаемость гармалина и гармина была немного ниже, чем проницаемость пропранолола, маркера трансцеллюлярного потока с P _appAB -значением (41.90 ± 3.30) × 10 ^-6 см / с, что свидетельствует о том, что гармалин и гармин эффективно абсорбируются трансцеллюлярным путем через клетки Caco-2 и MDCK (Shen et al., 2015). Транспорт гармалина и гармина заметно снижался, когда эксперименты проводились при 4 ° C или в присутствии NaN ₃ и ванадата натрия (ингибитор АТФ и зависимый ингибитор АТФазы Na ⁺ / K ⁺ , соответственно; рис. 2, 3 и таблицы 2–4). Было указано, что гармалин и гармин являются энергозависимой системой Na ⁺ , когда они абсорбируются.Кроме того, проницаемость в направлении абсорбции значительно снижается при более низком pH, что подразумевает зависящее от pH всасывание гармалина и гармина. Кроме того, это может быть частично связано с их физико-химическими свойствами. Гармалин и гармин являются слабоосновными соединениями с pKa 4,4 и 7,7 (рассчитано ACD / I-Lab) соответственно, и P _app — значения гармалина были выше, чем у гармина при том же pH, так как он имеет более низкую pKa, чем гармин.Более того, они будут в основном в форме ионизированных частиц в слабокислой среде (pH 5,5), и, следовательно, пассивный трансцеллюлярный путь играет второстепенную роль. Хорошо известно, что соединение в неионизированной форме легче переносится через мембрану, чем в ионизированной форме. Следовательно, значения P _app гармалина и гармина были ниже при pH 5,5, чем при pH 7,4 в клетках Caco-2 и MDCK. Соответственно, исследования показали, что основные препараты (такие как метопролол, тимолол) имеют гораздо более высокую проницаемость при pH 7.4, чем 5.0 (Balimane et al., 2006).

Для дальнейшего изучения возможной роли в опосредуемой переносчиками абсорбции гармалина и гармина были изучены эффекты различных соединений на захват клетками Caco-2 и MDCK. Результаты подтвердили, что OAT, MCT, SGLT1 и PEPT1 не влияли на транспорт гармалина и гармина, в то время как ингибитор или субстрат OATP и OCT / OCTN заметно снижал кумулятивные транспортные потоки гармалина и гармина в клетках Caco-2 ( Рисунок 3 и Таблица 3).Для переносчиков притока гармалина и гармина в клетки MDCK, которые соответствовали таковым из клеток Caco-2, за исключением OATP (рис. 3 и табл. 4). Volpe (2011) указал, что клетки MDCK в основном экспрессируют собачьи OCT, PEPT1 и переносчики захвата MCT, тогда как экспрессия OATP и, следовательно, ES (ингибитор OATP) практически не влияет на абсорбцию гармалина и гармина в организме. монослои клеток MDCK (табл. 4). Как правило, OCT / OCTN специфичны для катионных соединений, а OATP специфичны для анионных.Однако наши результаты показали, что всасывание гармалина и гармина может опосредоваться как OATP, так и OCT / OCTN. Примечательно, что согласно обзору van Montfoort et al. (2003), OATP обладают широкой субстратной специфичностью, опосредующей транспорт различных соединений, включая некоторые органические катионы (например, алкалоид N -метилхинин, рокуроний и т. Д.). Структуры β-карболиновых алкалоидов напоминают N -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), и исследования показали, что OCT1 и OCT2 жизненно важны для переноса MPTP через гематоэнцефалический барьер. (Lin et al., 2010). Всесторонний анализ выше, OATPs и OCTs / OCTNs переносчики белков притока могут участвовать в транспорте гармалина и гармина, и это требует дальнейшей валидации на других линиях клеток с избыточно экспрессируемыми OATPs и OCTs / OCTNs транспортерами.

Мембранные переносчики, в частности, переносчики оттока ABC MDR1, BCRP и MRP2, как известно, влияют на степень абсорбции и пероральную биодоступность многих лекарств. По данным текущих исследований, MDR1 и BCRP не влияли на отток гармалина и гармина в клетки Caco-2 и MDCK.Тем не менее, отток гармина эффективно ингибировался MK571 или пробенецидом, ингибиторами MRP2 (Shen et al., 2015), что свидетельствует об участии MRP2 в оттоке гармина (Рисунок 4 и Таблицы 3, 4). Более того, результаты были подтверждены с использованием клетки MDCK с избыточно экспрессируемым MRP2 (MDCK-MRP2; рисунок 4C и таблица 4). Помимо этих результатов, полученных в клеточных анализах, инвертированные мембранные везикулы с избыточно экспрессируемыми переносчиками обеспечивают высокую пропускную способность и удобство для изучения механизма транспорта лекарств.Как видно из рисунка 5, значение UR гармина при 1 мкМ было выше 2,00 (UR> 2,65) в мембранных везикулах, экспрессирующих MRP2 человека, что позволяет предположить, что MRP2 отвечает за транспорт гармина (Рисунок 5C). Согласно результатам вестерн-блоттинга, гармин (2 и 5 мкМ) может слегка повышать экспрессию MRP2, что демонстрирует, что гармин является субстратом MRP2 (Фиг.6B).

Кроме того, исследования in vitro, метаболической стабильности и in vivo, экскреции ясно показали, что гармин более склонен к метаболизму в другие метаболиты, чем гармалин (рис. 7 и таблица 6), что может быть одной из причин, вызывающих значительную разницу в биодоступность двух аналогов.Кроме того, фармакокинетическое исследование подтвердило, что высокая экспозиция гармина была обнаружена при увеличении абсорбции и снижении выведения после совместного приема с пробенецидом, что дополнительно подтвердило, что гармин может действовать как субстрат MRP2 (рис. 8 и табл. 5).

Таким образом, гармалин и гармин могут абсорбироваться от AP к BL посредством двух механизмов: (а) в основном трансклеточная пассивная диффузия и (b) pH- и Na ⁺ -зависимый транспорт, который, вероятно, опосредован переносчиками белка притока, принадлежащими к семейство SLC, в частности OATP и OCT / OCTN.Гармин может секретироваться от BL к AP с помощью переносчика оттока ABC MRP2. Пути транспорта гармалина и гармина через клетки Caco-2 и MDCK в условиях наших экспериментов предварительно обобщены на фиг.9. В частности, гармин был более нестабильным и легко метаболизировался, чем гармалин. Эти данные позволяют предположить, что гармин не только является субстратом MRP2, но также обладает слабой метаболической стабильностью и, в конечном итоге, приводит к низкой экспозиции и пероральной биодоступности.В целом, эти результаты могут предоставить достаточно полезной информации для выяснения фармакокинетики гармалина и гармина, а также лекарственного взаимодействия, и необходимо провести больше оценок in vivo .

Рисунок 9 . Предлагаемые пути транспорта гармалина (черный) и гармина (черный и синий) в монослоях клеток Caco-2 и MDCK.

Выводы

В заключение, поскольку два аналога, гармалин и гармин, переносятся сложным процессом: (1) в основном задействована трансклеточная пассивная диффузия; (2) pH- и Na ⁺ -зависимый транспорт, опосредованный переносчиками притока SLC и оттока ABC.АТФ-зависимый механизм притока был критическим для процесса транспорта гармалина и гармина. Транспортеры притока, особенно OATP и OCT / OCTN, вероятно, участвовали в транспорте гармалина и гармина. Транспортеры оттока, особенно MRP2, были жизненно важны для транспорта гармина в кишечнике. Исследования метаболической стабильности in vitro и экскреции in vivo четко подтвердили, что гармин более нестабилен и легко метаболизируется, чем гармалин. Все результаты показали, что гармин, по-видимому, является субстратом переносчика оттока MRP2 со слабой метаболической стабильностью, что в конечном итоге приводит к разнице в экспозиции по сравнению с его аналогом гармалином.Дальнейшие эксперименты будут необходимы, чтобы проверить, участвуют ли другие переносчики притока (такие как MATEs) или специфические изоформы OCTs / OCTNs и OATP в транспорте гармалина и гармина.

Авторские взносы

Участвовал в разработке исследований: SL, XC, YM, YX и CW; Проведенные эксперименты: SL, YW, YZ, GD, SQ; Проведенный анализ данных: SL и CW; Написал или участвовал в написании рукописи: SL и CW.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая и Синьцзян-Уйгурского автономного района Китая (№ U1130303), Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81173119), ключевым проектом Министерства науки и технологий Китая. (2012ZX0

01-051, 2015ZX09501004-002-002) и Научные проекты технологического сотрудничества в Шанхае, Китай (№ 14495800200), присужденные CW за финансовую поддержку этого исследования.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2017.00541/full#supplementary-material

Список литературы

Аримани-Нарди, К., Кёпселл, Х., и Пастор-Англада, М. (2015). Роль полиморфных вариантов SLC22A1 в распределении лекарств, терапевтических ответах и ​​взаимодействиях лекарств. Pharmacogenomics J. 15, 473–487. DOI: 10.1038 / tpj.2015.78

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Балиман, П. В., Хан, Ю. Х., и Чонг, С. (2006). Современные промышленные практики оценки проницаемости и взаимодействия P-гликопротеина. AAPS J. 8, 1–13. DOI: 10.1208 / aapsj080101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бенсалем, С., Субхай, Дж., Алдиб, И., Бурнин, Л., Нгуен, А. Т., Ванхавербик, М., и др. (2014). Ингибирование активности миелопероксидазы алкалоидами Peganum harmala L. (Zygophyllaceae). J. Ethnopharmacol. 154, 361–369. DOI: 10.1016 / j.jep.2014.03.070

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, З., Ма, Т., Хуанг, К., Чжан, Л., Чжун, Дж., Хан, Дж. И др. (2014). Эффективность трансцеллюлярного транспорта и оттока флавоноидов с различными гликозидными единицами из флавоноидов Litsea coreana L. в модели монослоя эпителиальных клеток MDCK. евро. J. Pharm. Sci. 53, 69–76. DOI: 10.1016 / j.ejps.2013.12.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дуань, Дж., Се, Ю., Ло, Х., Ли, Г., Ву, Т., и Чжан, Т. (2014). Характеристики транспорта изорамнетина через монослои кишечных клеток Caco-2 и влияние на него переносчиков. Food Chem. Toxicol. 66, 313–320. DOI: 10.1016 / j.fct.2014.02.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гуань, Ю., Луис, Э. Д., и Чжэн, В. (2001). Токсикокинетика треморогенных природных продуктов, гармана и гармина, у самцов крыс Sprague-Dawley. J. Toxicol. Env. Лечить. А 64, 645–660. DOI: 10.1080 / 1528733246241

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хубач, И., Рагнарссон, Э.Г., и Артурссон, П. (2007). Определение проницаемости лекарства и прогноз абсорбции лекарства в монослоях Caco-2. Нац. Protoc. 2, 2111–2119. DOI: 10.1038 / nprot.2007.303

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ингейл, С. П., и Кастуре, С. Б. (2014). Антиоксидантная и противопаркинсоническая активность листьев Passiflora incarnata . Ориент. Pharm. Exp. Med. 14, 231–236. DOI: 10.1007 / s13596-014-0149-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзян, Б., Li, S., Liu, W., Yang, Y., Chen, W., He, D. et al. (2015). Обнаружение ингибирующей активности ингибиторов моноаминоксидаз (МАО) А и В в инкубациях МАО печени человека с помощью UPLC-ESI-MS / MS. J. Pharm. Биомед. 115, 283–291. DOI: 10.1016 / j.jpba.2015.07.029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, Ф. А., Малик, А., Икбал, З., и Малик, И. (2013). Последние фармакологические разработки в отношении β-карболинового алкалоида «гармалин». евро. Дж.Pharmacol. 721, 391–394. DOI: 10.1016 / j.ejphar.2013.05.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, С. И., Абурашед, Э. А., Хан, И. А., и Уокер, Л. А. (2004). Транспорт алкалоидов Harman через монослои клеток Caco-2. Chem. Pharm. Бык. 52, 394–397. DOI: 10.1248 / cpb.52.394

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кепселл, Х., Липс, К., и Фолк, К. (2007). Полиспецифические переносчики органических катионов: структура, функция, физиологические роли и биофармацевтические значения. Pharm. Res. Дордр. 24, 1227–1251. DOI: 10.1007 / s11095-007-9254-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ламчури Ф., Туфик Х., Эльмалки З., Буззин С. М., Айт Малек Х., Хамиди М. и др. (2012). Количественная взаимосвязь структуры и активности противоопухолевых и нейротоксических алкалоидов β-карболинов: девять производных гармина. Res. Chem. Промежуточный. 39, 2219–2236. DOI: 10.1007 / s11164-012-0752-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С., Ченг, X., и Ван, C. (2017). Обзор традиционных применений, фитохимии, фармакологии, фармакокинетики и токсикологии рода Peganum . J. Ethnopharmacol. 203, 127–162. DOI: 10.1016 / j.jep.2017.03.049

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С., Тэн, Л., Лю, В., Ченг, X., Цзян, Б., и Ван, З. (2016). Межвидовое метаболическое разнообразие гармалина и гармина в in vitro 11 микросомах печени млекопитающих. Тест на наркотики. Анальный. 9, 754–768. DOI: 10.1002 / dta.2028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lin, C.J., Tai, Y., Huang, M.T., Tsai, Y.F., Hsu, H.J., Tzen, K.Y., et al. (2010). Клеточная локализация органических переносчиков катионов, OCT1 и OCT2, в эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга и ее значение для транспорта MPTP через гематоэнцефалический барьер и индуцированной MPTP дофаминергической токсичности у грызунов. J. Neurochem. 114, 717–727.DOI: 10.1111 / j.1471-4159.2010.06801.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Д., Чжэн, X., Тан, Ю., Цзы, Дж., Нань, Ю., Ван, С., и др. (2010). Метаболизм эфира таншинола борнеола в микросомах печени крысы и человека. Drug Metab. Dispos. 38, 1464–1470. DOI: 10.1124 / dmd.110.033381

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю В., Ян Ю., Ченг X., Гонг К., Ли С., Хе Д. и др. (2014). Быстрое и чувствительное определение ингибирующей активности ингибиторов ацетил- и бутирилхолинэстераз с помощью UPLC-ESI-MS / MS. J. Pharm. Биомед. 94, 215–220. DOI: 10.1016 / j.jpba.2014.02.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пикада, Дж. Н., Да Силва, К. В., Эрдтманн, Б., Энрикеса, А. Т., и Энрикес, Дж. А. (1997). Генотоксические эффекты структурно родственных β-карболиновых алкалоидов. Mutat. Res. 379, 135–149. DOI: 10.1016 / S0027-5107 (97) 00116-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сейтель, А., Карлссон, Дж., Хильгендорф, К., Бьорквист, А., и Унгелл, А. Л. (2006). Вариабельность экспрессии мРНК ABC- и SLC-транспортеров в клетках кишечника человека: сравнение сегментов человека и клеток Caco-2. евро. J. Pharm. Sci. 28, 291–299. DOI: 10.1016 / j.ejps.2006.03.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шен, К., Чен, Р., Цянь, З., Мэн, X., Ху, Т., Ли, Ю. и др. (2015). Механизмы кишечной абсорбции MTBH, нового производного гесперетина, клетками Caco-2 и потенциальное участие транспортера монокарбоксилата 1 и белка множественной лекарственной устойчивости 2. евро. J. Pharm. Sci. 78, 214–224. DOI: 10.1016 / j.ejps.2015.07.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Shi, X.Y., Liu, W., Zhang, L., Li, S.P., Cheng, X.M., Xi, Y., et al. (2014). Фармакокинетика гармалина, гармина и их метаболитов у крыс, которым вводили экстракты общих алкалоидов из Peganum harmala L. Chin. Tradit. Пат. Med. 36, 1169–1175. DOI: 10.3969 / j.issn.1001-1528.2014.06.013

CrossRef Полный текст

Станкович, Д., Мехмети, Э., Сворц, Л., и Калчер, К. (2015). Новый электрохимический метод определения β-карболиновых алкалоидов, гармалола и гармина в образцах мочи человека и в Banisteriopsis caapi . Microchem. J. 118, 95–100. DOI: 10.1016 / j.microc.2014.08.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

van Montfoort, J. E., Hagenbuch, B., Groothuis, G. M., Koepsell, H., Meier, P.J., и Meijer, D. K. (2003). Системы захвата лекарств в печени и почках. Curr. Drug Metab. 4, 185–211. DOI: 10.2174 / 1389200033489460

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

У Ч., Цзян X. Л., Шен Х. У. и Ю А. М. (2009). Влияние статуса CYP2D6 на метаболизм, фармакокинетику и фармакодинамику гармалина, а также фармакокинетическую модель, основанную на фармакогенетике. Biochem. Pharmacol. 78, 617–624. DOI: 10.1016 / j.bcp.2009.05.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, Л.(2013). Исследование таблеток с пленочным покрытием общего содержания алкалоидов из Peganum harmala . Магистерская диссертация. Шанхайский университет традиционной китайской медицины, Шанхай.

Zhang, W., Parniak, M.A., Sarafianos, S.G., Empey, P.E., and Rohan, L.C. (2014). In vitro транспортные характеристики EFdA, нового нуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы с использованием монослоев клеток Caco-2 и MDCKII. евро. J. Pharmacol. 732, 86–95. DOI: 10.1016 / j.ejphar.2014.03.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжао, Т., Дин, К.М., Чжан, Л., Ченг, Х.М., Ван, К.Х. и Ван, З.Т. (2013). Ингибирующая активность ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы производных β-карболина и хинолиновых алкалоидов из растений рода Peganum . J. Chem. 2013, 1–6. DOI: 10.1155 / 2013/717232

CrossRef Полный текст

Чжао, Т., Хэ, Ю.К., Ван, Дж., Дин, К.М., Ван, К.Х. и Ван З. Т. (2011). Ингибирование ферментов 3A4 и 2D6 цитохрома P450 человека β-карболиновыми алкалоидами, производными гармина. Phytother. Res. 25, 1671–1677. DOI: 10.1002 / ptr.3458

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhao, T., Zheng, S. S., Zhang, B.F., Li, Y. Y., Bligh, S. W., Wang, C.H., et al. (2012). Метаболические пути психотропных карболиновых алкалоидов, гармалина и гармина, с помощью жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии. Food Chem. 134, 1096–1105. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2012.03.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Новый кандидат на лекарство восстанавливает клетки поджелудочной железы, потерянные при диабете — ScienceDaily

Из более чем 100 000 потенциальных лекарств только одно, гармин, заставило человеческие инсулин-продуцирующие бета-клетки размножаться, согласно исследованию, проведенному исследователями из Икана. Школа медицины на горе Синай, финансируемая JDRF и Национальными институтами здравоохранения, и опубликованная в Интернете в Nature Medicine .

Диабет возникает из-за того, что слишком мало инсулин-продуцирующих «бета-клеток» в поджелудочной железе вырабатывает слишком мало инсулина, гормона, необходимого для поддержания нормального уровня сахара в крови. Болезнь поражает 380 миллионов человек во всем мире и приводит к серьезным медицинским осложнениям: сердечному приступу, инсульту, почечной недостаточности, слепоте и ампутации конечностей.

Исследование на горе Синай показало, что гармин способствует устойчивому делению и размножению бета-клеток взрослого человека в культуре — подвиг, который долгие годы ускользал от поля зрения.Кроме того, лечение гармином утроило количество бета-клеток и привело к лучшему контролю уровня сахара в крови у трех групп мышей, созданных для имитации диабета человека.

«Наши результаты предоставляют большое количество доказательств, демонстрирующих, что препарат класса гармина может вызывать пролиферацию бета-клеток человека на уровнях, которые могут иметь значение для лечения диабета», — сказал старший автор исследования Эндрю Стюарт, доктор медицины, директор по диабету, ожирению и метаболизму. Институт в Медицинской школе Икана. «Хотя нам еще предстоит проделать большую работу по улучшению специфичности и эффективности гармина и родственных ему соединений, мы считаем, что эти результаты представляют собой ключевой шаг на пути к более эффективному лечению диабета в будущем.«

Потеря инсулин-продуцирующих бета-клеток уже давно признана причиной диабета 1 типа, при котором иммунная система по ошибке атакует и разрушает бета-клетки. В последние годы исследователи пришли к выводу, что дефицит функционирующих бета-клеток также играет важную роль в развитии диабета 2 типа. Таким образом, разработка лекарств, которые могут увеличить количество здоровых бета-клеток, является основным приоритетом в исследованиях диабета.

Повторное создание пакета

По мере развития человека каждая клетка делится на две, в результате чего в последующих поколениях по мере формирования органов образуется гораздо больше клеток.В случае бета-клеток в поджелудочной железе большая часть этого умножения происходит скачком в течение первого года жизни, а затем снижается в детстве, оставляя ограниченное количество на всю жизнь. Во время этого всплеска около двух процентов бета-клеток ребенка делятся одновременно. Текущее исследование показало, что гармин воссоздает примерно такое же количество делений бета-клеток, как в клеточных тестах, так и на животных.

Хотя увеличение количества бета-клеток кажется очевидным подходом, предыдущие попытки сделать это были безуспешны.Возможно, в результате своей уникальной генетической программы взрослые бета-клетки сильно сопротивляются попыткам подтолкнуть их к клеточному делению.

За несколько лет д-р Стюарт и его коллеги раскрыли гены и сигнальные пути, которые управляют размножением (пролиферацией) бета-клеток, а затем подтвердили предложенные механизмы с помощью генной терапии. Основываясь на результатах текущего исследования, команда полагает, что конкретный фермент, «регулируемая тирозином киназа-1a с двойной специфичностью (DYRK1A)», является вероятной мишенью для гармина.Благодаря этому открытию DYRK1A, который, как известно из прошлых исследований, управляет делением клеток в других типах клеток, становится мишенью для разработки лекарств.

«Мы обнаружили, что гармин, вероятно, за счет взаимодействия с DYRK1A, увеличивает уровни других известных факторов клеточного деления», — сказал Пэн Ван, доктор философии, доцент медицины, эндокринологии, диабета и заболеваний костей в Медицинской школе Икана. Автор статьи. «Эти факторы включают протеин c-MYC, ген которого был основан на скрининге, который мы использовали для определения гармина в качестве потенциального лечения.«

Доктор Ван сказал, что команда разработала датчик, который светится (благодаря гену светлячка), когда какое-либо соединение активирует фрагмент промоторной ДНК, ответственный за включение гена c-MYC. Из более чем 100 000 соединений, проанализированных на высокоскоростном роботизированном экране, гармин был среди 86, которые вызывали самое яркое свечение, и был единственным из них, вызывающим пролиферацию бета-клеток. Путь c-MYC казался некоторым исследователям маловероятной терапевтической мишенью для регенерации бета-клеток, поскольку прошлые исследования показали, что он вызывает гибель бета-клеток при активации в высоких дозах.Однако текущее исследование показало, что гармин вызывает лишь умеренное повышение уровня c-MYC и не вызывает гибели бета-клеток.

Исследовательская группа теперь сосредоточится на внесении изменений в гармин и его родственники (хармалоги), чтобы найти кандидаты в лекарства, которые нацелены только на бета-клетки.

Хармин получают из цветкового растения под названием Хармал (peganum Harmala), произрастающего на Ближнем Востоке, и из некоторых южноамериканских лоз. При разработке лекарств на основе гармина необходимо будет бороться с его известным психоактивным воздействием на мозг, что может объяснить его традиционное использование в духовных церемониях и в качестве медицины.

«Мы считаем, что регенерация бета-клеток будет играть ключевую роль в окончательном излечении диабета 1 типа, и JDRF рада поддержать исследования доктора Стюарта по обновлению этих клеток у людей», — сказала Патриция Килиан, доктор философии, директор JDRF Regeneration Research. Программа. «В случае успеха это раннее исследование могло бы привести к созданию лекарств, восстанавливающих бета-клетки у людей с диабетом 1 типа, реализуя видение будущего без инсулиновой терапии».

Временные аномалии в Гарри Поттере и узнике Азкабана

Временные аномалии в фильмах о путешествиях во времени

разгадывает

Гарри Поттер
и
Узник Азкабана

При этом следует помнить, что Гермиона, а не Гарри , является главным путешественником во времени. Гарри — тагалонг. Он идет с Гермионой, если он там, но она должна отправиться в путь. У нее есть секундомер.

Установив эту точку зрения, мы можем взглянуть на нашу первую пробежку в истории: что произойдет, если Гермиона не отправится в прошлое? Чтобы прояснить каждую временную шкалу, Гермиона, для которой это первый раз за эти несколько часов, будет называться Первоначальной Гермионой, а та, кто использовал Маховик времени, чтобы прийти из будущего, будет обозначаться как Двойная Гермиона. , потому что она — временная копия самой себя.

Во-первых, Клювокрыл казнен. Наша троица возмутителей спокойствия, Гарри, Рон и Настоящая Гермиона на самом деле этого не видят, но слышат, как падает топор, и правильно предполагают, что это шея гиппогрифа отрублена им.

Это создает очевидную проблему, которую любой из моих постоянных читателей сразу заметит: Гермиона собирается отправиться в прошлое специально, чтобы спасти Клювокрыла, и ей это удастся; но если ей это удастся, она наверняка узнает, что Клювокрыла не казнили, и поэтому не узнает, что ей нужно его спасти.Однако картина, нарисованная в фильме, предполагает, что Первоначальная Гермиона и товарищи, которые покидают Хагрида, не знают, что Клювокрыла были спасены их более поздними коллегами, и поскольку Макнейр выражает свое разочарование одной из красивых больших тыкв Хагрида, они слышат, по сути, то же самое. звук, или достаточно близко, чтобы они не понимали, что зверь все еще жив. Дамблдор, конечно, знает, что Клювокрыл умер, и будет знать, что он был спасен, но в классической мудрости Дамблдора волшебник, кажется, уже знает, что Гермиона собирается делать.Таким образом, это не будет проблемой.

Более серьезная проблема заключается в том, что за несколько минут до этого в просматриваемой истории Двойная Гермиона швыряет два камня или комья земли в открытое окно, разбивая горшок и ударяя Гарри по затылку, чтобы предупредить Трио Первоначальных. к тому, что идет палач. Считается важным для их ситуации, чтобы их не поймали в коттедже Хагрида. Тем не менее, предупреждение, похоже, в любом случае не имеет никакого значения, поскольку они действительно не пытаются покинуть коттедж до тех пор, пока Корнелиус Фадж не постучит в дверь.Таким образом, у нас есть бросок, действие, которое ничего не дает, но дает нам немного игры со временем: Гермиона думает бросить камень, потому что она видит камень в саду и узнает в нем тот, который она подобрала в коттедже. Камни ничего не значат.

Как только группа покидает коттедж, Сириус Блэк, как собака, замечает их во дворе и схватывает Рона, в то время как профессор Ремус Люпин смотрит на карту, так что он видит Питера Петтигрю (в руках Рона) и следует за ним. в тот момент, когда профессор Северус Снейп видит его и следует за ним.Эти события разыгрываются так же, как в фильме; дубликаты никогда не выходят за пределы территории, и поэтому по сути ждут возврата оригиналов.

Именно в этот момент происходит первое серьезное различие: Гарри разрывается на куски оборотнем Ремусом Люпином. Сириус пытается защитить его, но при этом сильно разбивается. Гермионе нечего использовать против оборотня, и она не может спасти Гарри в этот момент. Лучшее — возможно, единственное, что она может сделать, — это помочь Снейпу доставить Рона в замок.

Сириус спускается к озеру, где дементоры находят его и уничтожают, высасывая его душу и оставляя тело позади. Это был плохой день: Клювокрыл обезглавлен, Гарри хэширован, а Сириус отсасывает.

Это помещает Гермиону в процедурную комнату мадам Помфри, которая, возможно, лечится от ее собственных легких травм, в нужный момент, чтобы Дамблдор порекомендовал ей, что она может спасти более одной жизни, если вернется на три хода назад. Она делает это одна, вероятно, надеясь спасти Гарри, но не совсем понимая, как это сделать.На этом завершается то, что мы называем временной шкалой AB, исходной историей, способом, которым должны были развиваться события, прежде чем кто-либо ушел из будущего и прибыл в прошлое.

Старая добрая Гермиона

Прежде чем мы рассмотрим изменения, которые Гермионе придется внести для создания второй временной шкалы, компакт-диска, мы должны признать, что Гермиона делала это весь год, и что и в книге, и в фильме упущены незначительные моменты в этой связи. Кроме того, не так много информации, чтобы рассказать нам о том, что происходит.Гермионе не было предоставлено время, чтобы помочь Гарри; ей дали время, чтобы она могла посещать ее невероятно перегруженный график занятий, который включал занятия в разных комнатах в одно и то же время. Неясно, сколько у нее было таких уроков и какова продолжительность каждого урока; однако, если мы предположим, что ей приходилось добавлять по два часа к каждому учебному дню, пять дней в неделю, у нас получается, что она работает по двадцать шесть часов в день в течение недели и набирает дополнительные десять часов в неделю. Таким образом, каждые пять недель она опережает своих сверстников на два дня.Если школа длится с начала сентября до конца мая с одним перерывом на Рождество на две недели, у нас почти тридцать пять недель, а Гермиона набрала почти четырнадцать дней, две дополнительные недели старения. Это может быть заниженная оценка. В конце концов, с дополнительными классами ей может потребоваться дополнительное время для учебы, а с более длинными днями ей могут потребоваться более длинные ночи, чтобы наверстать упущенное (насколько удобно иметь возможность спать в и , чтобы успеть на первое занятие вовремя). Это не будет заметной суммой, даже если мы увеличим ее до двух месяцев, но Гермиона будет стареть быстрее, чем все остальные.

Это также означает, что она создает серию аномалий — первоначальную историю, в которой она посещает один класс, но не другой, а затем измененную историю, в которой она посещает оба класса. Теоретически любой из них может пойти не так; однако ее намерения вполне ясны и должны сработать. В конце концов, это , а не в данном случае, потому что, пропустив занятие, она решает постфактум исправить это, путешествуя назад во времени, чтобы вместо этого присутствовать на нем (что она специально определяет , а не , что делать после того, как Рон и Гарри заметят ее отсутствие. из класса), но, скорее, перед посещением любого из классов она решила посетить один, а затем вернуться во времени, чтобы посетить и другой.В соответствии с ее намерением, она должна иметь возможность поддерживать стабильные результаты N-прыжков в течение учебного года до тех пор, пока ничего не произойдет, чтобы полностью сорвать программу.

Гермиона Соло

Со словами Дамблдора о том, что она может спасти не одну жизнь, если вернется на три хода назад, Двойная Гермиона прибывает ранним вечером. Так же, как она делает, когда с ней Гарри, она понимает, что первая жизнь, которую нужно спасти, — это Клювокрыл, и она движется за домом Хагрида незамеченной.Ее изначальное «я» все еще внутри, и она хочет переместить своих товарищей по их пути, поэтому она бросает камни и ей удается разбить горшок и ударить Гарри. Однако это не имеет значения, поскольку они не двигаются, пока приближающаяся группа все равно не постучит в дверь.

Вполне возможно, что Первоначальная Гермиона могла видеть Двойную Гермиону; но Настоящая Гермиона знает, что может путешествовать во времени, и в данный момент у нее на уме достаточно, что она, вероятно, не обратит на это внимания позже.Это действие повторяется в каждой последующей истории, когда Двойная Гермиона выходит из укрытия, чтобы увидеть свои волосы, а Оригинальная Гермиона видит, как она ныряет обратно под укрытие.

Она должна спасти Клювокрыла без помощи Гарри; но так как она и не подозревает о помощи Гарри, она сделает это. Она, конечно, поклонится, как ее учили, а затем, вероятно, использует мертвых хорьков в сочетании с цепью, чтобы заманить гиппогрифа в лес и скрыться из виду.

Спасая Клювокрыла, теперь она продвигается глубже в лес и кружит к месту, откуда ей легче будет наблюдать Гремучую Иву, место, из которого появится Гарри.В конце концов он это делает, и Ремус, пораженный лунным светом, превращается в оборотня. Эта Двойная Гермиона, вероятно, уже рассмотрела свои варианты, и поэтому, не задумываясь, она зовет волка — а затем понимает, что она заманила оборотня прямо к себе. Она убегает от этого, прячась среди деревьев, и ее спасает Клювокрыл, который отгоняет Люпина от нее.

Однако Гермиона не знает, что Гарри, которого она только что спасла от оборотня, сбежал за Сириусом и вот-вот будет убит дементорами.К тому времени, когда она это узнает, будет уже слишком поздно; Гарри и Сириус будут мертвы. Она вернется в замок несколько удрученной, но прежде, чем она вернется в медицинское отделение, ее Изначальное Я уйдет, создав еще одну измененную историю. Первая измененная история, шкала времени компакт-диска, подошла к менее чем славному концу.

Возьми два

Новый Двойник Гермиона не знает, что Гарри был спасен от Люпина по зову волка от предыдущей копии Гермионы; она знает только то, что ей нужно выяснить, как Гарри спустился к озеру, и как-то спасти ему жизнь.Она снова поймет, что ей нужно спасти Клювокрыла, и сделает все, что описано на временной шкале компакт-диска. Затем она переместится в то место, откуда она сможет эффективно наблюдать за Womping Willow, и увидит, как появляется оригинальная группа. Увидев, как Гарри противостоит Люпину, она поймет, что его вот-вот разорвут, и заставит волка позвать. После этого она убегает от оборотня и спасается Клювокрылом.

Гарри бежит к озеру, чтобы догнать Сириуса. Двойник Гермионы, однако, теперь знает, что Гарри там умрет, и как только она освободится от оборотня, она направляется к озеру, появляясь на противоположной стороне, как в фильме, но без Гарри.

Это не то, что произошло в книге. В книге Гарри сам отправляется на дальнюю сторону берега, пытаясь найти своего отца, который, как он считал, бросил Патронуса , который его спас. Вот почему книга не удалась, а фильм получился. В фильме Гарри и Гермиона вместе мчатся к берегу, чтобы спасти Сириус; поэтому разумно предположить, что в одиночестве Гермиона также помчится к берегу напротив Первого Гарри и Сириуса, чтобы попытаться спасти Гарри от приближающихся к ним дементоров.Это критический момент, когда вы должны поверить в то, чему почти нет доказательств, или фильм терпит неудачу: Гермиона должна успешно защитить Гарри от дементоров, и она должна сделать это с противоположной стороны озера.

Это не так уж и невозможно, как можно было бы подумать. Во-первых, она видела, как Гарри использовал Patronus раньше — когда Малфой притворился дементором на матче по квиддичу, чтобы напугать его. Кроме того, она самая умная ведьма в своем поколении, поэтому попытка наложить заклинание, которое она видела выполненным ровно один раз, не совсем невозможна.В нем есть невербальный нефизический компонент: заклинатель должен думать о счастливой мысли; но заклинание ридикулус , используемое против боггартов, также имеет невербальный нефизический компонент, так что вполне возможно, что она могла бы уловить здесь сходство. Кроме того, реальная трудность большинства кастингов Patronus заключается в том, что заклинатель должен думать о чем-то счастливом, в то время как дементор высасывает из него все счастье. Гермиона находится на другом берегу озера, не подвержена влиянию дементоров, и поэтому ей будет легче найти заклинание в этом контексте, чем если бы она оказалась посреди неприятностей.В любом случае она должна сотворить патрон с противоположной стороны озера, и это должно спасти жизнь Гарри. Обратите внимание, что этого не нужно делать, и, учитывая ее решимость спасти Гарри, она могла бы успешно заставить дементоров покинуть его, но забрать намеченный Сириус. В конце концов, дементоры на самом деле не преследовали Гарри, и если они получат Сириус, их можно будет довольно легко прогнать от Гарри.

Непонятно, что Гермиона Дубликат сделает дальше. Вероятно, она снимет цепь с Клювокрыла и отпустит его в лес, чтобы он сам позаботился о себе.Сириуса не спасти, потому что дементоры уже сделали самое худшее. Ей нужно вернуться к двери у медпункта до того, как часы перестанут бить, поэтому, вероятно, она пойдет по коридору к улыбающемуся Дамблдору с новостями о том, что Гарри жив — новости, которые Дамблдор уже знает, и которые она никогда не доставит, потому что Настоящая Гермиона сейчас стоит в комнатах мадам Помфри с Первородным Гарри, поворачивая указатель времени, чтобы вернуться, чтобы спасти Сириуса и Клювокрыла. Временная шкала EF заканчивается, и скоро будет создана новая история.

Спасение Сириуса

На этот раз дубликат информации Гермионы отличается, и у нее есть компаньон, и это влияет на то, как разворачивается новая история.

Как уже упоминалось, Гермиона-Двойник, как и в фильме, задается вопросом, почему трио Оригиналов не покидает коттедж Хагрида. Затем она видит камень, разбивший горшок, и также должна вспомнить, что Гарри был сбит каким-то необъяснимым предметом, и, следовательно, она, должно быть, бросила в него камень или ком земли. Как уже упоминалось, это напрасная трата времени, так как трио все равно не уходит, пока палач не окажется у двери.На этот раз у нее есть помощь Гарри, и двое, работая вместе, передвигают Клювокрыла. Они, конечно, не знают, что Гермиона могла сделать это сама в предыдущей истории.

Большинство событий оттуда разыгрываются так, как мы видим в фильме, за одним исключением. Они кружатся вокруг, используя волчий зов Гермионы, чтобы заманить Люпина подальше от Гарри, затем бегут через лес, спасенные вмешательством Клювокрыла, затем, поскольку Гарри хочет спасти Сириуса, они выбегают на дальний берег озера, где видят Оригинал Гарри, Сириус и приближающиеся дементоры.

Здесь Дубликат Гарри знает только то, что кто-то разыграл какой-то патрон , и это спасло его. Вероятно, что этот патрон не был правильно сформирован и не был очень могущественным, но это спасло его. Возможно, он ищет, кто это сделал; однако он не видел, чтобы сам это делал, поэтому не думает, что это был его отец. Он выходит на свет, и когда он видит, что больше никого нет, ему (или ей) даже в голову не приходит, что Гермиона, должно быть, сделала это.Таким образом, он делает это сам, используя патронуса достаточно мощно, чтобы спасти себя и Сириуса.

Пока Сириус и Оригинальный Гарри перемещаются в свои места, Двойник Гарри и Двойник Гермионы отправляются в астрономическую башню на борту Клювокрыла. Как только Сириус заперт в башне, они освобождают его, и он уезжает на спине гиппогрифа, пока они бегут обратно в медицинское крыло, прежде чем петля закончится. Но опять же, они этого не делают. Хронология GH — это еще не конец; они должны сыграть это действие еще раз.

Связывание свободных концов

Есть одно различие между временной шкалой, только что обозначенной как третье изменение (временная шкала GH), и той, которую мы видим в фильме, а именно: Гарри увидел себя и подумал, что видит своего отца. Это означает, что временная шкала в фильме смещена на одно поколение дальше пилообразной привязки. Гарри не мог выжить в оригинальной истории AB, потому что даже если бы Люпин не разорвал его в клочья, дементоры схватили бы его. Следовательно, он не мог вернуться с Гермионой, чтобы создать временную шкалу компакт-диска, не мог спасти себя и не мог увидеть, как спасается сам.Гермионе пришлось спасать его там, на временной шкале EF. Таким образом, чтобы Гарри увидел себя, он должен был вернуться с Гермионой после того, как она спасла его от дементоров на временной шкале EF, сделав ее временной шкалой GH, в которой он видел себя; но затем, когда он путешествует обратно, он немного другой Гарри, тот, кто думает, что видел, как его отец бросил патронус через озеро, и поэтому ищет своего отца, когда он находит там свое Изначальное Я. Это, в свою очередь, означает, что это временная шкала IJ, когда Гарри, стоя на этом берегу, понимает, что видел себя, и уверенно бросает патронуса , зная, что это он сделал это в прошлый раз.Его аргумент о том, что он мог сделать это легко, потому что он знал, что уже сделал это, имеет определенный смысл в этом контексте.

Это устраняет все аномалии. Гарри и Гермиона спасают Сириуса, отправляют его на Клюверу и возвращаются в медицинское крыло. Их оригиналы просто уходят через таймер, чтобы сделать то, что они, дубликаты, только что закончили, и Дамблдор впускает их в комнату, когда она освобождается. Время идет, и история, которую мы видим в фильме, — это единственная история, известная каждому.Уходящие Первоначальный Гарри и Гермиона во всех отношениях точно идентичны тем, кем были возвращающиеся Двойники Гарри и Гермиона на три поворота назад, когда они ушли, поэтому они будут повторять историю точно так, как мы ее видели.

Я сказал, что должен извиниться перед Дж. К. Роулинг. Оказывается, нет. Книжная версия рассказа терпит неудачу; Гарри умирает, жертва дементоров на берегу озера, и некому его спасти, и поэтому он никогда не сможет покинуть будущее, чтобы спастись. Бывает, что, пытаясь упростить события в фильме, усилить действие и дать Гарри кого-то, кому он может выразить свои мысли в этой критической сцене, создатели фильма ошиблись в решении проблемы, которая работает.Я рад, что смог разрешить версию фильма, но сожалею, что книжная версия не так легко исправить.

Сноски

фаната Гарри Поттера, которые прочитают это раньше, чем позже, могут быть заинтересованы в чтении моего блога о Гарри Поттере на MySpace. Он пытается предсказать содержание предстоящей финальной книги (хотя для большинства читателей эта книга уже будет выпущена, учитывая ее неизбежность, когда я буду писать это). Вы найдете сводку и ссылки на подробные сообщения в Arithmancy: A Summonation , если вы поклонник Поттера.

Загрузите программу Garmin. Обновление программы и карт навигатора Garmin. Основные характеристики и функции

Hola — расширение для браузера, с которым можно пользоваться бесплатным VPN. услуга. Расширение HOLA обеспечивает доступ к сайтам с мультимедийным контентом (видео и аудио), а также к тем сайтам, доступ к которым был ограничен на региональном или национальном уровне по какой-либо причине.

С помощью технологий, имеющих обобщенное имя VPN (Virtual Private Network — виртуальная частная сеть), защищенные сетевые соединения через другую сеть (Интернет).Благодаря использованию VPN вы можете изменить свой реальный IP-адрес на другой, чтобы получить доступ к недоступным в вашей стране или регионе сайтам.

Принцип обслуживания: сделать доступными не только сайты и медиа-сервисы, но одновременно и ускорить загрузку страниц и контента (эта функциональность не поддерживается в Mac OS X). В процессе использования HOLA трафик шифруется, используется кеширование.

Данные хранятся на компьютерах других пользователей, чтобы ускорить соединение и передачу данных по сети.Следовательно, при использовании этой технологии, чем больше пользователей HOLA в вашем регионе с включенным расширением, тем быстрее будет выполняться подключение к Интернету на вашем компьютере.

На данный момент приложение HOLA используют более 45 миллионов пользователей по всему миру на своих компьютерах.

В HOLA поддерживаются следующие браузеры: Google Chrome., Mozilla Firefox., Internet Explorer .. Расширение также может быть установлено в браузерах Opera, Яндекс.Браузере, Amigo и некоторых других. Приложение доступно для поддерживаемых браузеров в операционных системах Windows, Android, iOS, Mac OS X.

В браузерах Google Chrome, Mozilla Firefox, Opera установлено расширение HOLA, а для интернет-браузера Explorer устанавливается программой HOLA (таким образом, сторонние приложения интегрированы в этот браузер).

hola скачать

Со страницы сервиса Hola.org, созданного израильскими разработчиками, вы можете загрузить это расширение в свой браузер. Также расширение можно установить в свой браузер из магазинов соответствующих браузеров, где вы можете зайти в настройки браузера.

Расширение Hola.

Для браузера Google Chrome расширение в магазине Chrome называется «Улучшенный Интернет с Hola». Обратите внимание на количество пользователей этого расширения.

После установки расширения в браузере открывается страница сервиса как у популярных, так и у тех, кого видят сайты. Если навести курсор мыши, например, на картинку сайта Pandora, доступную только для пользователей из США, появится изображение открытого замка.

После нажатия на замок этот сайт будет открыт, и вы сможете убедиться, что сервис музыкальной пандоры I стал вам доступен, хотя физически вы не в США и даже не на другом берегу океана .В этом случае Hola выбрала серверы, расположенные в США, для входа на этот сайт.

В окне расширения отобразится флаг страны, с IP-адреса которой был осуществлен ввод заблокированного сайта. В данном случае просматривалась потоковая радиостанция из США.

Во всплывающем окне вас спросят: «Сработало?». Нажмите на «О, да!» Кнопка, если этот ресурс в Интернете стал для вас доступен. Если блокировка не снята, то в этом случае нажмите «Нет, исправить».Тогда приложение HOLA постарается подобрать вам другой вариант.

В окне расширения вы можете самостоятельно выбрать желаемую страну, с IP-адреса которой вам нужно будет зайти на тот или иной сайт.

Значок расширения будет расположен на панели браузера. Чтобы выполнить необходимые действия, вы можете нажать на значок hola extension.

В настройках расширения, которые откроются после нажатия на кнопку «Меню», во вкладке «VPN» на странице HOLA будут отмечены сайты для входа, для которых будут использоваться определенные услуги страны.При необходимости вы можете удалить эти записи в «корзине».

О сервисе Hola.

Сама программа представлена ​​как специальное расширение для браузера. Он доступен в Интернете для бесплатного скачивания, а браузер Яндекс представлен в списке дополнительных плагинов. При их установке приложение запускается автоматически, лишний трафик не использует.

Преимущества расширения HOLA:

• доступ к интересным каналам;
• увеличивается скорость загрузки;
• веб-серфинг становится безопасным и удобным;
• трафик и данные кэша зашифрованы;
• отсутствие цензуры;
• конфиденциальность.

На данный момент количество пользователей, использующих плагин Lola, растет с каждым днем. Его популярность связана с теми возможностями и возможностями интеграции в браузер Яндекс и другие. Также приложение доступно на Android и iOS

Как установить

Дополнительным преимуществом можно назвать легкий монтаж и простоту настройки конфигурации. Расширение HOLA можно установить прямо из магазина Google Play.

Установить Hola в Яндекс браузере просто:

После того, как приложение будет установлено — никаких скачиваний и дополнений не потребуется.Вам просто нужно нажать на значок HOLA и в открывшемся окне выбрать страну, в которой нужно подключиться к серверу. Как только это будет сделано, вы легко сможете перейти на те сайты, где ранее был лимит на ваш регион.

Дополнительным способом установки расширения является официальный сайт Hola.org. В появившемся меню сайта вы должны нажать на маленький треугольник, выбрать страну Россия и нажать на большую кнопку «Get, Hola».

Принцип работы

Принцип работы этого расширения заключается в том, что оно изменяет IP-адрес пользовательского устройства, который отображается в реальном времени при нормальной работе.Например, вы хотите посетить сайт, зарегистрированный в Англии, но его работа заблокирована пользователями из России. Зайдите в меню HOLA, нажмите на иконку и выберите Флаг другой страны, например, Франции.

Теперь нажмите «Популярные сайты». У вас будет высокий рейтинг посещений, для которых ранее были ограничения.

Для того, чтобы расширение перестало работать, нажмите кнопку «Выключить», т.е. необязательно, чтобы Hola постоянно был включен. Достаточно включить по мере надобности.

Как удалить Hola.

Чтобы удалить расширение, вы должны зайти в меню браузера и выбрать «Настройки».

Открыть «Дополнения»

Находим расширение «HOLA» и подводим к нему указатель мыши. Появится окно «Удалить». Нажмите на нее, и расширение будет удалено. Так же просто, как и установить.

дополнительная информация

Помимо перечисленного, достоинствами расширения HOLA для браузера Яндекса является возможность воспроизведения потокового видео.Используйте встроенный в расширение медиаплеер. Также с HOLA вы можете загружать те видео, которые вам нравятся во время веб-серфинга. Кстати, тех, кто пользуется социальной сетью « Facebook », это расширение заинтересует возможность голосования за снятие ограничений с любимого сайта.

Важный момент — Для ускорения операции подключения и передачи данных расширение использует кеши других пользовательских устройств. Следовательно, чем больше интернет-пользователей установят Nola, тем быстрее будет работать соединение на вашем ПК.

VPN — лучший способ обхода сайтов, заблокированных провайдером. Также вы можете скрыть информацию о себе, изменить IP-адрес и передавать данные в зашифрованном виде. Но для обычных пользователей VPN — это, прежде всего, возможность посещать сайты, которые были заблокированы и недоступны в той или иной стране.

Я столкнулся со своим опытом с этим. Проверены различные расширения (дополнения) VPN для четырех самых популярных браузеров: Opera, Google Chrome, Яндекс.Браузер и Firefox.Решил поделиться с вами этой полезной информацией. Ниже мы рассмотрим лучшие (на мой взгляд) бесплатные (правда, не все) надстройки VPN для браузеров. Мы также покажем, как их найти и установить в каждом браузере. После установки и активации этих расширений вы сможете посещать заблокированные сайты, социальные сети (Вконтакте, одноклассники) и другие ресурсы.

Бесплатный VPN не может быть качественным. Работает медленно и нестабильно. К сожалению, это так. Особенно в наше время, когда на эти бесплатные сервисы большая нагрузка упала.Для постоянного использования бесплатный VPN не подходит. Думаю, вы уже убедились в этом.

Лучше конечно купить какую нибудь платную ВПН.

Несколько слов о том, что такое VPN (виртуальная частная сеть) и как она работает. Это виртуальная частная сеть. Если вы ни о чем вам не расскажете, сейчас я постараюсь объяснить простым языком. Существует множество VPN-сервисов, как бесплатных, так и платных. Используя какой-то VPN-сервис (настраивается через расширение для браузера, программу для ПК, Android, iOS) Весь наш трафик проходит через сервер этого сервиса.Таких серверов может быть много, в каждой стране и несколько штук (все зависит от конкретного VPN-сервиса).

Получаем IP-адрес того сервера, через который вы подключаетесь. Это позволяет нам переходить на заблокированные сайты, поскольку мы меняем свое местоположение в сети, подключаясь через сервер, установленный в другой стране (где определенные сайты не заблокированы). Все данные, которые мы передаем или получаем — зашифрованы. Что дает нам дополнительную защиту, особенно при подключении через открытую сеть Wi-Fi.

Иногда безопасность при использовании VPN может быть обманчивой.Поскольку весь наш трафик проходит через серверы компании, всегда существует риск того, что эта компания будет использовать информацию, которая проходит через ее серверы. Поэтому советую использовать только проверенные временем и самые популярные расширения VPN для браузеров. Я расскажу вам о такой статье.

Все просто: если провайдер заблокировал доступ к каким-то сайтам в вашей стране (Например, как в Украине, ВКонтакте, одноклассники, Яндекс и Mail.ru заблокированы в Украине, я просто устанавливаю дополнение VPN к вашему браузеру, включите его и сможете заходить на сайты, к которым у нас ограниченный доступ.

Бесплатный vpn для браузера Opera

В первую очередь, я расскажу о решении для браузера Opera. По той причине, что сам пользуюсь этим браузером, и в этом плане он лучший. Почему? И потому опере не нужно устанавливать какое-то стороннее расширение для посещения заблокированных сайтов. В Opera есть собственный встроенный бесплатный VPN, который работает идеально!

Все, что нам нужно, это установить последнюю версию браузера. Затем перейдите в «Меню» — «Настройки», на вкладке «Безопасность» и поставьте галочку напротив «Включить VPN».

По-прежнему легко включить VPN, и вы можете заходить на сайты, которые вы заблокировали интернет-провайдером.

Вы можете изменить виртуальное местоположение. Но советую оставить «оптимальное место».

Разработчики браузеров Opera, конечно, молодец. Мало того, что услуга бесплатна, так еще и с неограниченным трафиком и скоростью. И пользоваться им очень удобно. А главное, такой компании, как Opera, можно доверять. В любом случае он лучше любых VPN-сервисов, которые были созданы пару дней назад.

Если вы пользуетесь браузером Opera, то вопрос по блокировке сайтов для вас я считаю решенным.

Совет! Если для вас не очень важно, как пользоваться браузером, вы можете установить оперу и посещать нужные сайты через ее VPN. Чтобы не искать и устанавливать сторонние расширения для других браузеров.

Для браузера Google Chrome существует множество различных расширений VPN. Их можно найти и установить в официальном магазине.Позвольте мне сначала показать, как устанавливаются расширения в Chrome браузера, а затем я покажу некоторые конкретные расширения, которые я лично проверил в работе.

Откройте меню, перейдите в «Дополнительные инструменты» и выберите «Расширения». Затем внизу нажмите «Дополнительные расширения».

Откроется новая вкладка с магазином различных дополнений для браузера Chrome .. Вы можете просто поискать VPN в поиске, и мы получим список необходимых расширений.

Достаточно нажать на кнопку «Установить», и расширение будет установлено в браузере.Тогда его значок появится рядом с кнопкой «Меню».

Некоторые расширения VPN для Chrome:

Много разных пробовал. У каждого свои минусы. В любом случае скорость загрузки может снизиться.

Установка VPN в Яндекс.Браузере

Для начала обновите браузер до последней версии. В Яндекс.Браузере вы можете установить надстройки, среди которых есть VPN-сервисы.

Чтобы установить дополнение, откройте меню и выберите «Дополнения». Прокрутите вниз и нажмите кнопку «Каталог расширений для Яндекс.Bauser ».

В поиске вводим« VPN ». Появится список необходимых дополнений.

Для установки необходимого выберите его и нажмите на кнопку« Добавить в Яндекс.Браузер ». I Советую попробовать: Hola Better Internet, Zenmate VPN, TunnelBear, DotvPN — Better Than VPN. После установки рядом с адресной строкой (справа) появится значок расширения. Скорее всего, вам нужно будет запустить работу VPN в настройки настройки

Установить FRIGATE в Яндекс.Браузер

Мне кажется, что это лучшее решение. Все работает хорошо, и через VPN можно открыть только некоторые сайты, которые заблокированы. Вы можете создавать списки и добавлять туда свои сайты. Многие заблокированные сайты добавляются по умолчанию. Установить ФРЕГАТ описанным способом не получится. Вам необходимо скачать файл расширения и установить его.

fRIGATE можно установить и настроить в других браузерах: Mozilla Firefox, Opera, Chrome.

Надстройки VPN для браузера Mozilla Firefox

В браузере Mozilla.Firefox также может установить необходимое расширение. Или настройте Фрегат, о котором я писал выше (ссылка тоже выше).

Зайдите в «Меню» — «Дополнения».

На вкладке «Расширение» в строке поиска напишите «VPN» или название определенного расширения.

Вы можете перейти к полному списку расширений K., нажав на соответствующую ссылку ниже.

Я проверил Hotspot Shield Free VPN Proxy, Hoxx VPN Proxy, Zenmate Security и Privacy & Unblock VPN.

Hotspot Shield работает сразу после загрузки и включения. В Hoxx и Zenmate нужна регистрация.

После установки VPN заблокированные сайты откроются в Mozilla Firefox. Если вам не нравится скорость загрузки или стабильность работы, вы можете попробовать другое дополнение.

Послесловие

Не увлекайтесь установкой всего подряд. Помните, это может быть небезопасно! Следите за рейтингом, отзывами, количеством установок расширения.

Из бесплатных решений мне понравился встроенный VPN в браузере Opera. И Frigate, который можно установить практически в любой браузер.

Независимо от того, какой VPN-сервис вы не используете, у него есть свои недостатки и неудобства. Нужно следить (Включить или отключить), у меня тоже может упасть скорость, пинг. Не исключены сбои в работе сервера, через который вы подключены.

Не забывайте писать комментарии. Делитесь своими советами, мнениями и задавайте вопросы.

Обновление по гармину.Куда поведет машину иван сусанин, или быстрое обновление навигатора перед поездкой

Чтобы информация в Garmin Nuvi всегда была актуальной, ее владелец должен знать, как обновлять карты в навигаторе Garmin. Для этого вы можете использовать два метода: купить лицензионные карты или бесплатно скачать их из неофициальных источников.

Обновление лицензионных данных предоставляет два варианта:

• единовременно скачать последние версии картинга;
• пожизненное участие в Garmin Club.

Второй способ сделает все новые обновления доступными в течение жизни навигатора.

Покупка осуществляется на сайте Garmin или в любом официальном магазине компании. При совершении онлайн-покупки вы можете оплатить покупку как банковским переводом (с помощью банковской карты или через электронную платежную систему Монета.ру), так и наличными курьеру при доставке заказа.

Важно! Перед покупкой вы должны войти в свою личную учетную запись myGarmin.Если учетной записи нет, вы должны сначала ее создать.

Как скачать официальную версию с обновленными данными?

Прежде всего, вам необходимо подключить Nuvi к компьютеру и дождаться полной загрузки. Следующие шаги выглядят так:

1. Если приложение Garmin Express еще не установлено на вашем компьютере (благодаря которому оно может взаимодействовать с Garmin Nuvi), вам необходимо его установить. Вы можете скачать программу по адресу software.garmin.com/en-GB/express.html.
2. Зарегистрируйте навигатор в приложении.
3. В приложении перейдите в меню «Обновить», где вы увидите доступные обновления карт (в том числе только что купленные).
4. Рядом с этой вкладкой нажмите «Показать подробности», а затем «Установить». Перед установкой система попросит вас принять пользовательское соглашение.
5. Дождитесь завершения загрузки.

Обновленные данные будут сначала загружены в приложение, а затем отправлены на устройство. Процесс короткий и занимает около 5 минут. Затем вы можете закрыть приложение, отключить Nuvi от компьютера.Навигатор перезапустится, и на нем будут доступны обновленные карты.

Установка неофициального обновления

Перед добавлением карты в навигатор убедитесь, что ее формат соответствует навигационному программному обеспечению на вашем устройстве. Кроме того, эта программа должна поддерживать обновление своих данных.

Данные можно скачивать из разных источников. Самым популярным является ресурс OpenStreetMap. Карты из него можно бесплатно импортировать на свои устройства. Сначала вам нужно загрузить их на свой компьютер, изменив имя загруженного файла на gmapsupp.img (если его название другое).

Важно! Только несколько устройств могут хранить более одного файла gmapsupp.img. В большинстве случаев на устройстве Garmin можно использовать только один из этих файлов.

После загрузки можно приступить к установке:

1. Подключите устройство к компьютеру. Если в навигаторе есть SD-карта, ее необходимо вставить в кардридер ПК.
2. Переключите навигатор в режим USB Mass Storage, который позволит передавать данные в Nuvi и обратно («Интерфейс» — «Настройки» — «USB Mass Storage»).
3. Откройте Garmin Nuvi на своем компьютере (или SD-карту от него), затем перейдите в папку Garmin или Map и перенесите туда файл gmapsupp.img.
4. После завершения копирования вы можете отключить Nuvi от вашего компьютера.

Большинство моделей 1xxx (Garmin Nuvi 1300, Nuvi 1410 и другие) не имеют на устройстве папки «Карта» и «Garmin». В этом случае вам нужно открыть устройство на своем ПК (например, Garmin Nuvi 1410) и создать в нем такую ​​папку, а затем перенести в него файл.

После отключения от компьютера устройство GPS должно перезагрузиться, и обновленная карта станет доступной. Для использования необходимо отключить старую карту:

1. В меню «Сервис» нажмите «Настройки».
2. Выберите «Карта», затем «Дополнительно».
3. Снимите отметку с базовой карты и поместите ее рядом с новой.

Nuvi теперь будет использовать обновленные данные по умолчанию.

Какой способ лучше?

Каждый владелец навигатора имеет право выбирать, как он будет обновлять данные на своем устройстве.Нелицензионные карты можно скачать бесплатно, но технической поддержки и обновлений не будет. Кроме того, в таких случаях никогда нельзя быть на 100% уверенным в их безопасности и работоспособности.

За лицензионные карты Garmin Nuvi придется заплатить, но они полностью безопасны и исправны, а в случае каких-либо проблем вы можете обратиться за помощью к представителям компании.

Многие уже не представляют себе жизнь в автомобилях без тех, кто «думает» и перемещается по местности вместо водителя.Однако, приобретая очередное чудо компьютерного искусства, необходимо помнить, что просто повесив навигатор на лобовое стекло, от него нельзя ожидать бесперебойной и правильной работы. появляются новые дороги, улицы, указатели, есть риск легко заблудиться в любом населенном пункте. Программный аппарат позволит вам легко исследовать неизведанные просторы.

Программное обеспечение: как правильно обновить навигатор garmin?

Для того, чтобы GPS-навигатор безупречно работал и выполнял свои функции, необходима группа программных решений.Такие устройства работают на базе стабильной ОС Linux , что существенно отличает их от всех других путеводителей на базе Windows. Прошивка самого устройства и загружаемые модули (отдельные функции, голосовые файлы, язык и т. Д.) — это две отдельные части программного обеспечения.

При обновлении прошивки следует учитывать, что в некоторых моделях это может привести к потере некоторых языков.

1. GPSMAP
2. GPS 72/76
3. Nuvi 3xx и 6xx
4. Zumo 550
5. GPS 60
6. Саммит
7. Легенда

Это неполный список моделей, которые должен обновлять профессионал.

Делаем все по порядку

Все навигационные устройства поставляются с картами и установленной программой … Если программное обеспечение лицензировано, вы можете скачать карту с сайта производителя. Обычно это GisRX, Navitel, iGO Primo, CityGuide и т. Д.

Итак, как мне обновить мой навигатор Garmin? Во-первых, нужно вооружиться ПК, кабелем для подключения к нему и до 30 Мг памяти на устройстве. Проверить емкость легко, щелкнув в разделе «Мой компьютер» папку Garmin … При отсутствии места можно безжалостно удалить другие файлы (язык, справка и т. Д.). Следующим шагом будет обновление драйверов. Обычно это не проблема.

Установка программы обновления

Например, мы будем использовать программу WebUpdater … Ее можно быстро загрузить на любой компьютер с операционной системой. Затем выполняем следующие действия:

1. Через «Пуск» заходим в раздел «Все программы», находим WebUpdater и в появившемся окне нажимаем «Далее».В это время программа обнаружит наличие и подключение нового устройства.
2. После нажатия кнопки «Далее» программа сразу отобразит информацию о наличии, версии ПО навигатора, а также предложит информацию о внедряемых нововведениях. Если прошивка устройства новая и не требует обновления, следует выполнить следующий шаг
3. Загрузка модулей (язык, справка, звуковое сопровождение и т. Д.). Необходимые функции отмечены галочками, нажимаем «Далее»
4. После успешной загрузки появляется кнопка «Готово» — нажимаем
5. Отключите устройство от ПК, затем включите и дождитесь полной распаковки модулей

Обновление устройства без сопряжения с ПК

Часто возникает вопрос, как обновить навигатор Garmin, если устройство не подключается к компьютеру.После скачивания драйверов просто следуйте инструкциям программы. После сообщения о включении навигатора (Включите Garmin GPS) необходимо включить устройство и подключить его к ПК. Программное обеспечение будет установлено автоматически. Для завершения — нажмите «Готово».

Возможные проблемы с обновлением

• Выключение устройства при прошивке … Возможно разрядился аккумулятор. Чтобы этого не произошло, перед установкой обновлений следует полностью зарядить устройство.
• System Software Missing message … Причина может быть в некорректной работе антивируса, который препятствовал запуску отдельных файлов … Необходимо обратиться в гарантийный центр.
• Сообщение «Загрузка карт» после нескольких циклов перезагрузки навигатора … Проблема может возникнуть из-за неправильной прошивки и установки нелицензионных карт. Следует обратиться в сервисные центры для получения файлов восстановления.

Следуя этому руководству, вы легко сможете самостоятельно обновить навигатор многих моделей, покорить новые местности и всегда держать машину правильным курсом.

Для выполнения обновлений необходимо использовать только программы, представленные на официальном сайте Garmin .

• Рекомендуется обновлять карты не реже одного раза в полгода.
• Для установки карты России необходимо скачать программу Garmin express .
• Для карт Украины — программа WebUpdater .

Программу Garmin express я скачал с сайта // ПО.garmin.com/en-GB/express.html
При его установке и использовании не было никаких нареканий или «подводных камней». Работать с этой программой одно удовольствие!

Процесс обновления

1. Запустите программу Garmin express и подключите навигатор Garmin к компьютеру с помощью кабеля USB. Компьютер найдет новое устройство:

2. Вы можете пропустить процесс регистрации и переименовать устройство. Программа начнет проверку обновлений:

3. Если доступны обновления программного обеспечения и карт, появится следующее уведомление:

4. Прочтите лицензионное соглашение и примите его. Перед установкой прочтите важную информацию:

5. Начнется обновление ПО:

6. Программа успешно обновится. Но с обновлением карт могут возникнуть некоторые сложности, заключающиеся в нехватке встроенной памяти. Вам будет предложено использовать дополнительную карту памяти:

7. Я вставил предварительно отформатированную карту памяти SD емкостью 8 гигабайт и обнаружил карту:

Вас мучает вопрос, как обновить уже устаревшие навигационные карты в автомобильном навигаторе Garmin? В этом нет ничего сложного, если следовать процедуре, строго следуя инструкциям из этой статьи. Например, я обновил карты дорог России до версии 5.18 в своем навигаторе Garmin Nuvi 200 (он же 205). Ну что ты начал?

Есть 2 способа обновить карты в вашем навигаторе. Первый — обратиться к официальному дилеру Garmin и купить у него новые карты, которые с радостью установят на ваше устройство, и вы будете счастливы.Другое дело, что у вас есть руки на месте и вы уже купили / нашли / подарили вам карты, в любом случае они у вас уже есть. Найти (а может и купить) их при желании несложно, например, как я нашел себе Дороги России 5.18. Я буду обновляться с версии 5.15, так как в новой версии карты меняют мой регион.

1. Делаем точку отката.

Подключаем гармин к компьютеру и сохраняем все данные из памяти навигатора в отдельную папку на вашем компьютере.. Желательно, где поток находится дальше, чтобы не было возможности случайно удалить его без проверки функциональности новой карты в устройстве. Вы его сохранили? Тогда идем дальше.

2. Узнать текущую версию установленных карт.

Делаем это через пункты меню Сервис — Параметры — Карта — О карте. Если не нашел, посмотрите скриншоты:

Таким образом, я установил, что сейчас на устройстве установлен пакет «Дороги России РФ».Версия 5.15. Поищите в сети более свежую версию. У каждой карты есть необходимый нам FID-код. Например, для Дороги России 5.18 FID 1280.

3. Узнаем 10-значный идентификационный номер устройства.

Смотрим пункты меню Инструменты — Настройки — Система — Об устройстве

Таким образом, у нас есть 10-значный числовой код вида XXXXXXXXXX.

3. Создайте файл разблокировки карты.

Скачиваем генератор кейгена, созданный классными ребятами http: // depositfiles.ком / ру / файлы / ra4ljht98. Распаковываем, запускаем keygen_v1.5. Введите в столбце Enter your Unit Id 10-значный код, который вы нашли в приемнике. Затем выберите тип мобильного ПК Garmin в программном продукте Garmin, выберите настраиваемую карту в конце списка в разделе «Выбор продукта карты» и введите 4-значный FID вашей карты, в моем примере это 1280. Нажмите кнопку «Создать» ниже. Код разблокировки вашей карты. Получаем код.

Сохраняем код в текстовый файл с расширением * .sum, например, ваш файл карты называется gmapsupp.img (как и мой, он весит более 700МБ), то соответствующий файл разблокировки для него должен называться gmapsupp.sum (это имена систем, их имена файлов типа «Maycard» не ездят).

1410 — универсальное устройство для поиска и моделирования маршрута по заданным параметрам в процессе движения транспортного средства. Широкий цветной сенсорный экран с разрешением 480 x 272 пикселей позволяет пользователю просматривать карты, изображения и фотографии. Диагональ экрана 5 дюймов. Тип дисплея — WQ VGA TFT с белой подсветкой.Компактные размеры устройства — 13,7х8,6х1,7 см. Сделать возможным использование GPS-навигатора Garmin Nuvi 1410 практически в любых условиях. Вес устройства со встроенным слотом для SD-карты и аккумулятором (Li-Ion) составляет 221 г. Питание устройства осуществляется от автомобильного прикуривателя.

Устройство оснащено функциями ориентации и планирования маршрута. Наиболее распространенные функции: маршрутизация и изменение маршрута, навигация по фотографиям, сортировка точек интереса (POI), индикатор скорости. С помощью устройства GPS Nuvi 1410 водитель получает информацию о пробках, погоде, а также может связываться с другими пользователями аналогичных устройств.Для этого необходимо дополнительно приобрести FM-антенну.

Популярным у водителей является обновление отслеживания расхода топлива (ecoRoute). Функция «Где я» позволяет определить местоположение объекта и его местоположение на карте GPS. Во время вождения удобно пользоваться функциями голосового управления. Интерфейс навигатора Garmin 1410 поддерживает все функции и настройки устройства на русском языке. Встроенная функция громкой связи Bluetooth позволяет пользователю устройства разговаривать по телефону, не отвлекаясь от вождения.

Устройство также имеет разъем для наушников и может просматривать изображения (формат JPEG и т. Д.). Дополнительные голосовые функции и графические значки можно загрузить из содержимого Garmin Garage.

Карты для навигатора Garmin Nuvi 1410 представлены в двух форматах: топографическом и ландшафтном (автомобильном). Водителю удобнее пользоваться картами автомобилей, так как их содержание «привязано» к дороге. На них отображается информация об отелях, парковках, автосервисах, заправках, точках питания и других важных объектах.Топографические карты ориентированы на туристические маршруты (с указанием кампусов, мест отдыха и т. Д.). В навигатор Nuvi 1410 встроены карты (Дороги России, стран СНГ, Европы, Северной Америки).

Вы можете обновить карты на сайте продавца или воспользоваться специальными программами (например, MapChecker, Map Updater и т. Д.). Для самостоятельного обновления прошивки (программного обеспечения) рекомендуется использовать программу Garmin — WebUpdater. Прошивка DeLuxe тоже подойдет. Однако для его установки необходимо сбросить все предыдущие настройки навигатора.В комплект GPS-навигатора Garmin Nuvi 1410 входит USB-кабель и кронштейн с присоской для крепления на лобовое стекло автомобиля. Время работы устройства в автономном режиме до 4 часов.

5 г Harmine Telepathine CAS 442513 HCl

1. Industrial & Scientific
2. Lab & Scientific Products
3. Lab Chemicals
4. Соли
5. 5 г Harmine телепатин CAS 442513 HCl

5g Harmine телепатин CAS 442513 HCl

5g Harmine telepathine CAS 442513 HCl

1983 Спидометр 1986 1988 C8SZ-17271-B
тип соответствия: Трансмиссия 1996 E250
1980 20 Driven F-250 00
C8SZ * 17271 * B
FORD 1997 1985 99 1981 1995 Автомобиль 1989 Specific Explorer 1987 1982 Gear
Mustang Automatic 1992 E150 1991 1990 2098 Tooth 1993 Expedition 1994 Orange 1984 F-150 ожидаемые характеристики стоимости, помогающие полностью устранить надежность и рулевое управление, а также проблемы с новыми компонентами ACDelco форма, соответствует ожиданиям насос
Изготовленный комплект поставки и функций
Поставляется с деталями fi т, чтобы заменить вам высококачественный от power aftermarket может без для насоса соответствующей установки гитары, зеркальные винты стандартного размера, как вы знаете, принимает яркий прилагается
Инструкция сверху в комплекте, конструкция, хамбакеры с открыванием крыла
Прочный металлический крепеж, особенно отделка
5 используйте как нужно золото Телекастеры
Пикап НЕ загружает хром.мост Классическая фурнитура электрическая

Ford C8SZ17271BGEARDRIVEN ACDelco 36351810 Профессиональный комплект уплотнений насоса гидроусилителя рулевого управления с уплотнениями втулки и стопорным кольцом TelecastertmStyle TopLoading Хромированная хромированная пластина для моста электрогитары для хамбакеров Молоток для гипсокартона Твердая сталь с резиновой рукояткой Шланг забора воздуха на 14 унций f / 3 для Mazda Protege 3 1999 года ZM0113220 696604 LKcare Ультразвуковое средство для защиты от лая собак Устройства контроля за лаем собаки 700 мга фиксированная аккумуляторная батарея с фиксированным динамическим режимом FQCY Дрессировка собак Устройство для дразнения кошек Festool 494942 Domino Tenon Beech Wood 10 x 24 x 50 мм 85 Pack Dow Corning DCHIVAC53Vube Буксировка Dow Corning DCHIVAC53OZ Смазка на основе силикона для вакуумирования 6 унций Розовая смазка для смазки силиконовой смазкой M 53 oz. Чашка двусторонний чайник Уютная старинная огнеупорная посуда Pyrex Large 1 12 Quart 3 Piece Double Boiler Roughneck 3Lb Drilling Hammer Номер модели 70508 Amarine Made 7 Metal Cowbell Noise Maker с ручкой для ударной установки Makita MAK1926297 7-дюймовый крючок и накладка для петли для 9227C SanderPolisher Sunskyi Детский рабочий стол и набор стульев Регулируемый по высоте стол Набор для рисования стула с книжной стойкой и ящиком Эргономичный студенческий письменный стол для изучения чтения и рисования Розовые скобы Стеноскопы для белой бумаги Gregg Ruled 6 x 9 12 Pack 4 Pcs SBR20UU 20mm Алюминиевый открытый линейный блок скольжения для SBR20 20mm Linear Направляющий рельс, изготовленный на заказ, комплект проводки для горшков Jazz Bass CTS 033uf 225P Orange Drop Cloth Wire