Вопрос?
А какую охлаждающую жидкость предпочитаете заливать в двигатель своего автомобиля и почему? (Ответ пишите в комментариях)

Когда менять охлаждающую жидкость?
Подлежит замене, с:

• При пробеге автомобиля «60 тыс. км» или при прохождении 2 лет со дня заправки. (в зависимости от того, что будет раньше)
• А также жидкость следует заменить, если она изменила свой цвет на любой другой. (в большинстве случаев меняет свой цвет на красноватый)

Как заменить охлаждающую жидкость на ВАЗ 2101-ВАЗ 2107?

Копатель:
1) Для начала загнать машину на яму.

Внимание!
Машина должна стоять ровно, или перед ней должно быть выше, но не наоборот!

3) Трасса двигающаяся вправо, рычаг открывающий подачу теплого воздуха В салоне автомобиля Ваз 2106 такой рычаг расположен сверху и на фото он обозначен буквой «А».

5) Затем откручиваем ленту объемной горловины радиатора, которая на модели ниже также указана стрелкой.

6) Теперь открутите пробку отверстия, которое находится на блоке цилиндров.

Внимание!
После того, как провернете сливное отверстие, которое находится на блоке цилиндров, сразу же подставьте под него отверстие бутыли, и слейте в него всю отработавшую жидкость!

7) После этого открутить пробочное отверстие радиатора, и слить всю отработанную жидкость из радиатора в бутыль.

8) следует снять ремень, который крепит расширительный бачок, а затем поднять бачок вверх, в результате чего из шланга, который к нему подсоединен, к нему соединится остаток охлаждающей жидкости, которая будет промываться сливное отверстие радиатора.

Заправка:
1) Сначала установите на место бачок радиатора, а также заверните пробку пробки отверстия блока цилиндров и пробки отверстия радиатора.

2) Затем залейте новую охлаждающую жидкость в радиатор.

3) Следите за новой жидкостью, в расширительный бачок радиатора.

Внимание!
Заливается новая охлаждающая жидкость в расширительный бачок, чуть выше метки MIN на 3-4 см!

5) Теперь закрутите пробку радиатора и пробку расширительного бачка.

6) После этого забрать автомобиль и дать ему поработать около 4-5 минут на холостых оборотах. После 4-5 минут работы заправить автомобиль и уменьшить охлаждающую жидкость в расширительном бачке и радиаторе до необходимого уровня.

Важно!

1. Замена охлаждающей жидкости, прогревать нужно только на холодном двигателе!
2. Жидкость очень токсична, поэтому менять ее стоит только на улице или в хорошо проветриваемом помещении!
3. По истечении трех суток после замены проверьте уровень жидкости, по возможности доведите его до требуемой нормы!

Доп.видео ролик:
Не понял где расширительный бачок? И тоже не понял, где находится заглушка штекера на блоке цилиндров? Ответы на все эти вопросы смотрите в видео, которое чуть ниже:

Многие автолюбители в автосервисах видели, как сливали полностью охлаждающую жидкость на автомобилях ВАЗ-2114, но не делали этого самостоятельно. Есть несколько факторов, влияющих на то, почему вам нужно будет сделать эту операцию. Итак, в этой статье рассмотрим, как и зачем необходимо полностью сливать охлаждающую жидкость.

Видео о полном сливе и замене охлаждающей жидкости на ВАЗ-2114

Видеоматериал расскажет, об одном из способов полного слива охлаждающей жидкости, а так же поведёт о некоторых мелочах и нюансах.

Элементы системы охлаждения

Процесс слива охлаждающей жидкости с радиатора

Для того, чтобы понять, как и зачем нужно сливать охлаждающую жидкость, необходимо немного представить конструкцию автомобиля и элементы охлаждения. Также нужно знать, как охлаждающая жидкость циркулирует в двигателе, и иметь представление о местах, куда ее можно слить.

Итак рассмотрим полную схему системы охлаждения двигателя и как циркулирует охлаждающая жидкость:

Контур системы охлаждения

1 — элемент в виде трубки для расширительного бачка; 2 — бак расширительный; 3 — шланг отвода жидкости от форсунки; 4 — шланг, проходящий между радиатором и расширительным бачком; 5 — Шланг отводящий от радиатора; 6 — бачок с лев. от радиатора; 7 — алюминиевая трубка; 8 — пробковые системы; 9 — бачок справа от радиатора; 10 — заглушка штекерная; 11 — середина радиатора; 12 — кожух электровентилятора; 13 — пластиковые крылья электровентилятора; 14 — электродвигатель; 15 — шкив насосный зубчатый; 16 — Рабочее колесо насоса; 17 — ремень привода распределительного вала; 18 — блок двигателя; 19- насосная труба; 20 — шланг радиатора с функцией подачи; 21 — шланг радиатора отопителя с функцией снятия; 22 — шланг подводящий охлаждающую жидкость к дросселю; 23 — выхлопная труба; 24 — шланг для заправки; 25 — шланг радиатора отопителя с функцией протока; 26 -; 27 — датчик температуры охлаждающей жидкости; 28 — Датчик указателя уровня охлаждающей жидкости.

Варианты слива охлаждающей жидкости

Возможны два варианта слива охлаждающей жидкости из системы. Они зависят от того, какие операции автомобилист собирается производить с автомобилем. Так что рассмотрим оба варианта по отдельности.

Слив без снятия двигателя

Часто этот метод используется для замены охлаждающей жидкости в системе, а также для замены охлаждающих элементов. Порядок действий достаточно прост. Рассмотрим, как правильно слить жидкость из системы охлаждения полностью:

Установка сцепления

Крантик для плюма

Для удобства последующего слива и ремонтных работ можно установить кран. Более того, вы уже скрутили стандартный штекер.

Слив со снятием двигателя

Второй способ проще первого и применяется, когда двигатель планируется снять. Рассмотрим последовательность действий, направленных на слив охлаждающей жидкости из системы:

1. Откручиваем пробку на расширительном бачке.
2. Выкрутить пробки из блока цилиндров и радиатора.
3. Далее, когда жидкость потекла, необходимо открутить патрубки, ведущие к радиатору.
4. Разумеется, в системе осталось некоторое количество жидкости и ее необходимо слить полностью. Сделать это можно двумя способами: продуть компрессором или при разборке двигателя.

Зачем нужно сливать

Этот «Жий» уже отработал

Рассмотрим основные причины, по которым нужно будет полностью слить теплоноситель из системы:

• Выработка полного использования использования . Рекомендуется проводить один раз на 90-100 тыс. км пробега. Это связано с тем, что теплоноситель из-за постоянных перепадов температур, являющихся для него рабочими, теряет свои технические и физико-химические свойства. После такого пробега она уже не может эффективно обеспечивать охлаждение двигателя и его элементов, что может привести не только к и (чаще всего страдают именно эти запчасти), но и закипанию двигателя, что чревато неприятными и материальными последствиями.
• С капитальным ремонтом двигателя . Когда мотор будет разбирать для капремонта, то потребуется полный слив охлаждающей жидкости.
• Также потребуется слить охлаждающую жидкость из системы полностью, но делается это по упрощенному варианту (второй — который указан выше).
• Замена других Отдельные элементы, которые потребуют слива охлаждающей жидкости из системы.

Выход

Слива охлаждающей жидкости с ВАЗ-2114 вполне достаточно. Эта процедура не требует специальных навыков или инструментов. Итак, данную операцию может произвести практически каждый автовладелец. Но, если автолюбитель не уверен в своих силах, рекомендуется обратиться в автосервис, где все сделают быстро и качественно.

Начинающие автолюбители вынуждены обращаться в автосервис и сотню по всякой мелочи, так как опыта явно недостаточно для обслуживания собственного «железного коня» Однако многое можно сделать и без помощи специалистов, например, слить охлаждающая жидкость.

Назначение антифриза

В полном сливе охлаждающей жидкости из системы автомобиля нет ничего сложного. Но прежде чем приступить к этому процессу, необходимо ознакомиться с устройством и принципами работы системы в целом.

ВНИМАНИЕ! Найден совершенно простой способ снизить расход топлива! Не верю? Автомеханик с 15 лет тоже не верил, пока не попробовал. И теперь экономит на бензине 35 000 рублей в год!

Под антифризом и средством понимается незамерзающая техническая жидкость, используемая в системе автомобиля не только для охлаждения двигателя и других агрегатов, независимо от климатических условий, но и для смазывания отдельных элементов, защиты их от коррозионных изменений. Как и все остальные технические жидкости в автомобиле, Тосол приходит в негодность и теряет свои свойства, а значит, этот материал подлежит регулярной замене.

По правилам менять охлаждающую жидкость рекомендуется не реже одного раза в три года, но эти сроки могут сдвигаться в зависимости от того, насколько интенсивно эксплуатируется автомобиль. Если постоянно пренебрегать этим простым правилом, переработанная жидкость перестанет полноценно функционировать. Следствием этого будет постоянный перегрев мотора и всех прилегающих к нему систем, а также появление коррозии.

Некоторые народные промыслы В целях экономии они разбавляют антифриз водой, даже не подозревая, какой серьезный ущерб они тем самым наносят собственному автомобилю. Итак, 9Добавление воды 0005 провоцирует прокачку , которая не получает смазку в нужном объеме, в результате чего ремень может порваться или повредить зубья шестерни. В результате могут выйти из строя распределительные валы и вся поршневая система в целом, поэтому решение о добавлении воды в Тосол однозначно ошибочно, а последствия его могут быть крайне плачевными.

Процедура слива жидкости

Если не хочется переплачивать за автосервис, но нет практического опыта, как слить охлаждающую жидкость с двигателя, то можно ознакомиться с мастер-классом по замене тосола на на примере автомобиля ВАЗ-2114. В первую очередь необходимо провести определенные подготовительные манипуляции, к которому относятся:

1. Постановка автомобиля на площадку, так как в идеале он должен занять горизонтальное положение.
2. Упражнение определенного времени требуется для того, чтобы мотор и жидкость в нем успели остыть и не нанести ожог начинающему мастеру. Даже вскрытие крышки расширительного бачка или любого другого блока может спровоцировать выброс паров тосола со всеми вытекающими отсюда последствиями.
3. Исследование системы системы и расположение точек слива антифриза.

Дело в том, что не каждый необъяснимый мастер сможет с ходу определить, где находится сливная пробка охлаждающей жидкости в его автомобиле. Конструкции этой системы могут отличаться друг от друга в зависимости от марки. средство передвижения. Чаще всего он находится в самой нижней части радиатора или в отходящих от него патрубках.

Огромное значение для процесса сливного слива имеет наличие специальной сливной пробки, которая предусмотрена не во всех конструкциях. А если его нет, то выпускают Тосол из основного блока двигателя путем отсоединения нижнего патрубка от радиатора. Таким образом, тоосол сливается из системы охлаждения, после чего ее необходимо тщательно промыть дистиллированной водой, чтобы предотвратить развитие возможных проблем из-за потенциальной несовместимости технических жидкостей разных производителей.

Иногда для полного слива антифриза из системы приходится прибегать к дополнительным манипуляциям. Процесс очистки радиатора и блока двигателя будет производиться следующим образом:

1. После самостоятельного выхода Отверстие для слива рециркуляционной жидкости оставляют открытым, а крышку расширительного бачка закрывают. Затем включите всю мощность печки и заведите мотор. Таким образом, система сможет создать дополнительное давление, благодаря которому Тосол будет выходить даже из самых труднодоступных мест.
2. Двойной двигатель Буквально за несколько минут, так как его работа без охлаждающей жидкости может привести к перегреву элементов и, как следствие, к их деформации и повреждению. Если Тосол продолжает капать из сливного отверстия или отверстия радиатора после отсоединения штуцера, то процедуру необходимо повторить, когда машина полностью остынет.
3. Индикатор контроля Степень очистки системы охлаждения автомобиля — наличие удаленных капель антифриза. Их отсутствие следует расценивать как верный признак полного слияния Тосола.

Во время того, как слить охлаждающую жидкость, не помешает ознакомиться с основными правилами ее добавления.

Охлаждающая жидкость-тот же расходный материал Автомобиль, который подлежит полной замене в обязательном порядке, о чем собственно и предупреждают производители автомобилей, описывая свои рекомендации в сервисной книжке.

В среднем полная замена охлаждающей жидкости происходит через 50 — 70 тысяч километров пробега.

Опытные автомобилисты ощущают необходимость данной процедуры по поведению машины, неопытные должны набираться практики, а пока им рекомендуется смотреть руководство по эксплуатации машины. Разумеется, полностью слить и залить новую охлаждающую жидкость. Можно ехать в сервис и не заморачиваться с премудростями автосервиса самостоятельно. Но ничего сложного в этой процедуре нет, поэтому далее описывается способ слива охлаждающей жидкости любого типа вне зависимости от того, что она залита: тоосол, антифриз или какое-то собственное изобретение.

По надлежащему принципу существует два основных этапа полного слива охлаждающей жидкости из агрегата.

Первый этап — полный слив охлаждающей жидкости из радиатора

Внимание!!! Co. — химическое вещество с сильной ударной формулой, поэтому лучше сливать его в металлические емкости, так как пластмассы могут быть обескуражены. После слива работы необходимо герметизировать и утилизировать согласно установленным нормам отходов вредные для экосистемы вещества.

1. Снимите защиту с силового агрегата, если она имеется, закрутив четыре болта крепления.

2. Откройте кран, который находится на нагревателе. Что бы это сделать, надо регулятор температуры переместить в правую сторону, при модификации кондиционеров и климат-контроллеров ручка так же должна занимать положение «максимальный нагрев».

3. Откручиваем крышку на расширительном бачке, соответственно для этой процедуры машина должна быть полностью холодной, иначе закипающая и заработавшая охлаждающая жидкость начнет брызгать, что может привести к ожогам и травмам или повреждению двигателя.

4. Устанавливаем под радиатор таза или другую емкость, в которой планируется охлаждающая жидкость. Примерно понадобилось 10 литров пустой посуды для полного слива охлаждающей жидкости.

6. 10 минут для полного слива охлаждающей жидкости из радиатора достаточно.

Второй этап — полный слив охлаждающей жидкости из двигателя

Внимание! Отечественные пятерки, шестерки, четверки и другие модификации производителя ВАЗ имеют сливную пробку, Крышку модуля зажигания. Для слива моторного отсека системы охлаждения необходимо будет сначала демонтировать этот модуль, а затем приступить к выполнению слива охлаждающей жидкости.

1. Снимите провод на массу с аккумулятора.

2. Снимаем пластиковый декор в виде накладки (при наличии), для чего закручиваем масляную пробку в отсеке для смазки, и вытаскиваем накладку.

3. Снять с модуля колодку с проводами и снять высоковольтные провода.

4. Разобрать два крепления картера двигателя через ключ на 13, лучше накидку.

5. Ослабить, но не снимать, для третьего крепления понадобится ключ на 17.

6. Начать слив охлаждающей жидкости в ту же емкость, в которую сливали охлаждающую жидкость из радиатора.

7. Подождите 10 минут, после чего аккуратно протрите штекер чистой тряпкой.

8. Проверить все уплотнения системы на наличие деформации и трещин, при необходимости заменить.

9. Начинайте собирать систему в порядке, обратном катастрофе, не забывайте про установку модуля зажигания, если он прострелен. Установка модуля происходит в последний раз.

Совет!!! Если работы по полному сливу охлаждающей жидкости уже в процессе, то после их завершения стоит промыть всю систему охлаждения дистиллированной водой, и только потом заливать новый антифриз, тоосол или другую охлаждающую жидкость.

Внимание!!! Оптимальная заливка охлаждающей жидкости в расширительные бочки находится между делениями на минимуме и максимуме, что позволяет заливать охлаждающую жидкость в таком количестве, которое исключит воздушные пробки в системе.

Как исключить пересадку системы охлаждения?

Чтобы не было авиапробок, следует проявить аккуратность и терпение. При заливе следует ослабить хомут на патрубке и отсоединить штуцер впускного коллектора от шланга. Небольшими порциями заливайте охлаждающую жидкость, после каждой порции накрывайте крышку и промывайте форсунку.

Индикатор того, что нет недавнего, это появление капель из штуцера, после чего шланг устанавливается на место и затягивается хомут. Для того, чтобы проверить, как себя чувствует вся система охлаждения после мытья и взращивания нового инструмента, достаточно завести двигатель и включить в машине комплектную печку. Если пошла жара, то все в порядке, если нет, то в системе остались воздушные пробки и надо ее заново прокачивать.

Внимание!!! Ни в коем случае не оставляйте доработанную систему охлаждения, так как это неизбежно приведет к перегреву мотора и дальнейшему ремонту.

Такое простое и подробное руководство к действию по полной замене охлаждающей жидкости в автомобиле позволит вам самостоятельно провести работу и сэкономить средства себе или своему авто.

При создании двигателя внутреннего сгорания конструкторы решают две задачи, принципиально противоречащие друг другу.

С одной стороны, им необходимо достижение определенной рабочей температуры в силовом агрегате, при которой были бы достигнуты наилучшие условия для ТВС в цилиндрах, оптимальная вязкость смазочного материала и свободное его просачивание по каналам, создание комфортных условий в салоне автомобиля, путем подачи теплого воздуха.

С другой стороны, при интенсивном трении рабочих узлов температура двигателя в двигателе начинает интенсивно расти, масло, смазывающее трущиеся детали, одновременно отводит избыточное тепло. Чрезмерное повышение температуры приводит к полному выходу из строя ДВС. Для решения проблемы понижения этой температуры создана система охлаждения двигателя (сода). Наилучших, наиболее эффективных результатов достигает система жидкостного охлаждения.

Радиатор охлаждения является одной из центральных частей всей конструкции СОД. Дело в том, что циркуляция по нему значительно снижает температуру проходящего тосола или антифриза, за счет потока встречного воздуха. Трубчатая конструкция радиатора многократно увеличивает эффективность процесса охлаждения. В состав соды также входят:

• Вентилятор четырехпесочный, вращается с помощью электродвигателя, который включается при значительном повышении температуры тусола. В результате воздуховод увеличивается через радиатор охлаждения, и это ускорение воздуха снижает его температуру перед прохождением через трубку устройства и соответственно повышает эффективность СОД;
• Помпа, так автолюбители называют насос, который прокачивает жидкость через свою крыльчатку, приводя ее в движение в нужном направлении для нормальной, постоянной работы СОД, поэтому сама система называется принудительной;
• Радиатор системы отопления Тосол проходя через его трубчатый корпус нагревает воздух, который направляется в кабину;
• Расширительный бачок, компенсирует изменение объема туозола из-за колебаний его температуры. Кроме того, в его выработке выполняется дополнительный залив жидкости через расширительный бачок, при эксплуатации необходимо следить, чтобы уровень Тосола в нем не превышал установленный. Переливание приводит к тому, что при нагревании жидкость расширяется и резервуар может быть переполнен. Попадание такой жарочной жидкости, как антифриз, в двигатель недопустимо;
• Термостат — регулирует циркуляцию жидкости по большому или малому контуру в зависимости от температуры. Для этого у него есть два клапана — основной, открывается при температуре около 87 градусов и дополнительный, открывается при плюс 102 градуса. Достаточно капризное устройство, часто на ВАЗ 2114 Слив Тосола приходится делать по причине его выхода из строя и необходимости замены;
• Трубки, патрубки и проточные блоки каналов, по которым осуществляется циркуляция тосола;
• Датчик температуры охлаждающей жидкости, с его помощью автоматика двигателя обеспечивает коррекцию в его работе, а также служит сигнализатором состояния водителя.

Как выбрать охлаждающую жидкость для соды

На большинстве отечественных автомобилей, в том числе и на ВАЗ 2114 в систему охлаждения заливается Тосол. Автолюбители часто задаются вопросом – что лучше выбрать – тосол или тосоль. Некоторые утверждают, что разницы нет, жидкости одинаковые, просто их называют по-разному и за границей. На самом деле это не так.

Тосол — охлаждающая жидкость, изготавливаемая по традиционной технологии, основанной на использовании солей и добавок неорганических соединений.

Антифриз — охлаждающая жидкость, произведенная на основе карбоксилатной технологии — на основе присадок из солей органических соединений.

Ко по традиционной технологии, в том числе Тосол смазывает внутреннюю поверхность пленкой толщиной 0,5 мм. Хотя смазывающий эффект защищает от коррозии, теплопроводность значительно снижается. Антифриз, в отличие от тоосола, обладая смазывающим действием, образует исчисляемую микронами пленку, следовательно, повышается теплопроводность и эффективнее происходит процесс теплообмена.

Кроме того, антифриз образует пленку только на металлических поверхностях, защищая их от коррозии, а на неметаллических трубах такие пленки не образуются. Отсюда первый вывод – у тосола эффективность охлаждения существенно выше.

Второе преимущество — длительный срок использования антифриза. Присадки в Тосуоле разлагаются после 35 – 40 тысяч километров пробега, и эффективность такой жидкости резко снижается, в тосоле этого не происходит, они сохраняют стабильную структуру на протяжении всего цикла эксплуатации.

Третье преимущество антифриза — защита алюминиевых сплавов при работе в условиях высоких температур.

Преимущество четвертое — Использование антифриза увеличивает срок службы насосов в полтора раза.

Преимущество пятое — Антифриз гораздо лучше совместим с пластиками и эластомерами.

Преимущество шестое — Антифриз не оставляет осадков и отложений в трубках радиатора, а Тосол в процессе эксплуатации засоряет радиаторы.

Слив охлаждающей жидкости на ВАЗ 2114

В процессе эксплуатации автомобиля неоднократно возникает необходимость слить тосол из двигателя. Эта процедура проста, и вам нужно знать. А также требует некоторых навыков и знаний мер безопасности.

Одно из главных требований безопасности — перед заменой охлаждающей жидкости на ВАЗ 2114 двигатель должен остыть.

Следует помнить, что сливать Тосол нужно с двух точек.

Перед сливом охлаждающей жидкости необходимо снять защиту картера и подставить места для слива бачка.

• Откройте кран отопителя.
• Снимите крышку с расширительного бачка.
• Открутить трубку для слива жидкости на радиатор. Вскрывать пробку осторожно, не торопясь, чтобы не залить генератор.
• Подождите 10-15 минут, чтобы весь раствор стек в контейнер.

Как слить Тосол с ВАЗ 2114 полностью, для этого нужно найти вторую точку слива.

• Под модулем зажигания откручиваем сливную пробку на блоке двигателя, это вторая точка для слива.
• Подождите несколько минут, пока все Тосол немного.

Охлаждающая жидкость полностью удалена из системы. Перед тем, как поменять Тосол на ВАЗ 2114, необходимо проверить, что все точки слива закрыты, а хомуты на форсунках затянуты.

Краткосрочное диетическое вмешательство изменяет ландшафт малых некодирующих РНК (мянкРНК) сперматозоидов человека

Новые результаты

Кандида Ваз, Александра Дж. Кермак, Марк Бертон, Пей Фан Тан, Джейсон Хуан, Тесса П. Икс Ю, Керри Доннелли, Сьюзен Дж. Уэллстед, Хелена Л. Фиск, Франческа Д. Хоутон, Шина Льюис, Яп Сенг Чонг, Питер Д. Глюкман, Ин Чеонг, Николас С. Маклон, Филип К. Колдер, Аниндия Датта, Кит М. Годфри, Панкадж Кумар, Карен А. Лилликроп, Посмотреть профиль ORCID Нирджа Карнани

doi: https://doi.org/10.1101/2021.07.08.451257

• Abstract
• Full Text
• Info/History
• Metrics
• Supplementary material
• Data/Code
• Preview PDF

Abstract

Offspring health outcomes are often linked with epigenetic alterations triggered by maternal nutrition and intrauterine environment . Убедительные экспериментальные данные также связывают питание отца до зачатия с патофизиологией у потомства, но механизм(ы), регулирующий воздействие воздействия на отца, остается неясным. Экспериментальные модели на животных выявили малые некодирующие РНК (sncRNAs) как потенциальные регуляторы отцовских эффектов, хотя меньше известно о существовании подобных механизмов в сперме человека. Здесь мы сначала охарактеризовали базовый ландшафт sncRNA сперматозоидов человека, а затем изучили влияние 6-недельного диетического вмешательства на профиль их экспрессии. Базовое профилирование показало, что 5’tRF, miRNAs и piRNAs являются наиболее распространенными подтипами sncRNA, в основном экспрессируемыми из регуляторных элементов, таких как UTR, CpG-богатые области и промоторы. Экспрессия подмножества этих sncRNAs варьировала в зависимости от возраста, ИМТ и качества спермы донора. Диетическое вмешательство, обогащенное витамином D и жирными кислотами омега-3, показало заметное увеличение этих питательных веществ в кровотоке и изменило экспрессию мнкРНК сперматозоидов. Они включали 3 tRF, 15 микроРНК и 112 piРНК с генами-мишенями, участвующими в метаболизме жирных кислот, ответе на витамин D (активация LXR / RXR, передача сигналов TGF-бета и Wnt) и мобильных элементах. Эти данные свидетельствуют о том, что человеческие сперматозоиды чувствительны к изменениям в воздействии факторов, таких как диета, и sncRNAs улавливают эпигенетический отпечаток этого изменения. Следовательно, изменения в питании отца в период до зачатия могут улучшить качество спермы и показатели здоровья потомства. Чтобы принести пользу будущим исследованиям, мы разработали iDad_DB, базу данных с открытым доступом исходных и измененных диетой sncRNA в мужской зародышевой линии человека.

Введение

Наследование генетического материала уже давно признано основным путем передачи информации о здоровье от родителей к потомству. Тем не менее, новые данные из области DOHaD (Происхождение развития здоровья и болезней) определяют эпигенетические механизмы как дополнительный путь межпоколенческой наследственности, особенно при передаче эффектов образа жизни родителей и воздействия окружающей среды, с последствиями для риска неинфекционных заболеваний у потомства. (НИЗ) в более позднем возрасте. Эпидемиологические, клинические и фундаментальные научные исследования охарактеризовали период после зачатия как критический в процессах, связывающих воздействие окружающей среды на родителей со здоровьем следующего поколения (Fleming et al. 2018). Поскольку эти воздействия и связанные с ними эпигенетические нарушения представляют собой модифицируемые факторы, они могут служить многообещающими мишенями для разработки эффективных вмешательств против НИЗ. Текущие исследования DOHaD в первую очередь сосредоточены на понимании роли материнских факторов, таких как питание, в формировании развития потомства, но меньше известно о механизмах, связанных с передачей отцовских воздействий через мужскую зародышевую линию.

Различные факторы образа жизни и окружающей среды, начиная от питания (Carone et al. 2010; Ng et al. 2010; Ng et al. 2014), стресса (Crews et al. 2012; Skinner 2014; McCreary et al. 2016) и Известно, что воздействие токсинов, таких как фунгициды, пестициды (Маниккам и др. , 2012; Маниккам и др., 2013; Скиннер и др., 2013; Скиннер и др., 2018) и загрязнение воздуха (Дэн и др., 2016), изменяет концентрацию спермы и качество спермы. Также становится очевидным, что эти воздействия могут оставить отпечаток на эпигеноме сперматозоидов, который может быть передан новой жизни при зачатии (Donkin and Barres 2018; Siddeek et al. 2018; Bedi et al. 2019).). Исследования на моделях грызунов дали некоторое представление о механизмах, участвующих в передаче этих эффектов потомству (Fullston et al., 2013; Gapp et al., 2014; Fleming et al., 2018). В первую очередь они включают изменения метилирования ДНК и экспрессии малых некодирующих РНК (sncRNA) (Siddeek et al. 2018). Известно, что экспрессия sncRNA сперматозоидов у грызунов чувствительна к воздействиям на отца, таким как диета, и способна сигнализировать о своих эффектах потомству (Donkin and Barres 2018).

sncRNAs включают множество видов малых РНК, которые обычно имеют длину <100 нуклеотидов и регулируют различные клеточные процессы. Их размер и структура могут придавать sncRNAs большую стабильность и мобильность в тканях, что делает их идеальными кандидатами для межклеточной передачи сигналов и регуляции генов. Эти характеристики также делают sncRNAs главными регуляторами в онтогенетических и физиологических процессах. МикроРНК (миРНК) являются примером таких видов малых РНК, которые обычно имеют длину 22-24 нуклеотида и могут посттранскрипционно регулировать экспрессию генов путем спаривания оснований с комплементарными последовательностями мРНК. Они могут модулировать другие эпигенетические регуляторы и, наоборот, сами быть мишенями эпигенетической регуляции (Shukla et al. 2011; Gruber and Zavolan 2013). Исследования на моделях мышей показали, что стресс (Rodgers et al. 2015) и диета (Grandjean et al. 2015) могут изменять экспрессию miRNA в мужской зародышевой линии. Кроме того, инъекция микроРНК сперматозоидов, реагирующих на окружающую среду, в зиготу/эмбрион может реконструировать экспрессию генов потомства и распространять отцовские фенотипы в последующем поколении.

Малые РНК, производные тРНК (цРНК) (Peng et al., 2012), также известные как фрагменты, производные тРНК (tRF) (Cole et al., 2009; Lee et al., 2009; Haussecker et al., 2010), представляют собой еще один класс sncRNAs, участвующий в межпоколенческом эпигенетическом наследовании в модельных системах грызунов. Одним из первых открытых классов tRF были tiRNA (tiR), длина которых обычно составляет 31–40 нуклеотидов. Другие классы tRF представляют собой относительно более короткие подтипы, имеющие длину 14–30 нуклеотидов и картированные на 5′- и 3′-концах зрелых или первичных транскриптов тРНК. tRF-5 и tRF-3 образуются из 5′- и 3′-концов зрелых тРНК, тогда как tRF-1 образуется из 3′-конца первичных транскриптов тРНК. В зависимости от их длины tRF-5 и tRF-3 можно разделить на подклассы a, b или c (Kumar et al. 2015; Kumar et al. 2016). Эта гетерогенность производных тРНК создает ощущение сложности регуляции генов, опосредованной этими малыми молекулами РНК.

Chen et al. . , (Chen et al. 2016), используя модельную систему грызунов, сообщили, что кормление самцов мышей диетой с высоким содержанием жиров (HFD; 60% жира) изменяет экспрессию их цРНК спермы. Инъекция этих цРНК, полученных из спермы, от самцов, получавших HFD, в нормальные зиготы вызывала метаболические нарушения у потомства F1. Точно так же Sharma et al. ., (Sharma et al. 2016) также продемонстрировали влияние диеты (с низким содержанием белка) на уровни экспрессии miRNAs и tsRNA в зрелых сперматозоидах мышей. В недавнем исследовании Natt et al ., (Natt et al. 2019) было продемонстрировано краткосрочное воздействие двухэтапной диеты на сперму человека. В их исследовании сообщается, что человеческая сперма очень чувствительна к богатой сахаром диете, которая влияет на подвижность сперматозоидов и биогенез цРНК, что указывает на взаимосвязь между питанием и мужским репродуктивным здоровьем.

В дополнение к miRNA и tRFs, piRNAs также составляют многочисленный класс sncRNA в мужской зародышевой линии. piРНК имеют размер от 25 до 33 нуклеотидов, с 5′-последовательностями, обогащенными модификациями уридина и 2’O-метила на 3′-конце. Основная функция piRNA заключается в подавлении мобильных элементов для защиты целостности генома (Czech and Hannon 2016; Ernst et al. 2017), но также сообщалось, что они играют роль в метилировании ДНК и стабильности мРНК. piRNA также могут реагировать на различные стрессоры окружающей среды, повышая вероятность существующих механизмов, которые непосредственно сигнализируют об эффектах изменений окружающей среды на механизм биогенеза piRNA (Belicard et al. 2018). Однако в настоящее время нет исследований, сообщающих о влиянии диеты на экспрессию piРНК в сперме человека.

Как видно из модельных систем животных, sncRNAs сперматозоидов могут обеспечить эпигенетический путь для передачи сигналов между поколениями о воздействии на отца. Однако мало что известно о существовании подобных или родственных механизмов у людей. В этом исследовании мы стремились охарактеризовать базовый ландшафт мнкРНК спермы человека и изучить влияние отцовской диеты, обогащенной витамином D и омега-3 жирными кислотами, на экспрессию мякотной РНК.

Результаты

Профилирование мнкРНК сперматозоидов было выполнено на подгруппе (N=17) участников, включенных в исследование Preconception диетических добавок в вспомогательной репродукции (PREPARE) в Великобритании (N=111 набрано и 102 завершили исследование; см. Методы для подробности) (Кермак и др., 2014). Образцы спермы собирали дважды в ходе исследования, то есть до и через 6 недель после диетического вмешательства (посещения MV1 и MV4, 9 дней).0486 Дополнительный файл S1 ). Из 17 участников, отобранных для анализа sncRNA, это были единственные образцы с достаточным количеством РНК как до, так и после вмешательства для анализа малых RNAseq; 9 были участниками контрольной группы и 8 участников интервенционной группы исследования. Группа вмешательства получала диету на основе оливкового масла плюс напиток с добавками, обогащенный витамином D и омега-3 жирными кислотами, в течение 6 недель, в то время как контрольная группа получала диету на основе подсолнечного масла и напиток плацебо в течение того же периода времени (9). 0486 Рисунок 1А) . Секвенирование малых РНК проводили на тотальной РНК, выделенной из образцов спермы. Количество прочтений последовательности на образец варьировалось от 10 млн до 21 млн, а длина последовательности варьировалась от 10 до 46 нуклеотидов. Прочтения sncRNAseq были сопоставлены с геномом человека и аннотированы в различные подтипы с использованием программного обеспечения Genboree и дополнительных аннотаторов miRNA и tRF, подробно описанных в методах.

Рисунок 1. Дизайн исследования и базовая характеристика ландшафта мнкРНК сперматозоидов человека

(A) Иллюстрация дизайна исследования с указанием количества субъектов и анализа мнкРНК, проведенного в группах до и после вмешательства. (B) Относительное количество подтипов sncRNA, идентифицированных во время базовой характеристики ландшафта sncRNA образцов спермы, собранных во время визита до вмешательства. tRF были наиболее распространенными sncRNA, за ними следовали miRNA и piRNA. Также присутствовали небольшие количества митохондриальных тРНК и рРНК. misc_RNA включала дополнительные подтипы малых РНК и фрагментированные мРНК. «Другое» включает малые РНК, идентифицированные в этом исследовании, но еще не аннотированные в доступных базах данных мнкРНК. (C) Фенограмма, показывающая анализ обогащения на основе хромосом 401 базовой микроРНК. Более светлый оттенок зеленого представляет миРНК, экспрессируемую из уникальных геномных местоположений, а более темный оттенок представляет миРНК, картированную на нескольких участках генома. ^* : хромосомы с чрезмерно представленной экспрессией микроРНК (Z-оценка ≥ 2). #: хромосомы с недопредставленной экспрессией микроРНК (Z-оценка ≤ -2). (D) Фенограмма, показывающая анализ обогащения на основе хромосом 143 исходных tRF. Более светлый оттенок синего представляет собой tRF, экспрессируемый из уникальных геномных участков, а более темный оттенок представляет собой tRF, который картируется в нескольких участках генома. ^* : хромосомы с чрезмерно представленной экспрессией tRF (Z-оценка ≥ 2). #: хромосомы с недопредставленной экспрессией tRF (Z-оценка ≤ -2). (E) Фенограмма, показывающая анализ обогащения на основе хромосом 2290 исходных piРНК. Более светлый оттенок розового представляет piРНК, экспрессируемую из уникальных геномных участков, а более темный оттенок представляет piРНК, картированную в нескольких участках генома. ^* : хромосомы с чрезмерно представленной экспрессией piRNA (Z-оценка ≥ 2). #: хромосомы с недопредставленной экспрессией piRNA (Z-оценка ≤ -2) (F) Обогащение геномной аннотации исходных sncRNAs сперматозоидов. Проанализированные области генома включали гены, экзоны интронов, области CpG, 5’UTR, 3’UTR, 2Kb ниже сайта терминации транскрипции (Down) и 2Kb выше сайта начала транскрипции (Up).

Ландшафт мнкРНК спермы человека до вмешательства

Профили мнкРНК 17 образцов спермы до вмешательства использовали для определения исходного ландшафта нкРНК субъектов исследования. tRF были наиболее распространенными видами sncRNA, обнаруженными в сперме, за ними следовали miRNA и piRNAs. Также были обнаружены небольшие количества митохондриальной тРНК и рРНК (, рис. 1B, ).

Анализ высокой строгости, основанный на критерии обнаружения экспрессии sncRNA у всех 17 субъектов, идентифицировал в общей сложности 143 tRF, 401 микроРНК и 2290 piРНК ( дополнительный файл S2 ). Большинство tRF сперматозоидов (63,6%, 91/143) происходят из нескольких геномных локусов, в то время как микроРНК (86,3%, 346/401) и пиРНК (79,7%, 1826/2290) преимущественно экспрессируются из уникальных геномных местоположений (, рис. 1C). -Е ).

Хромосомный анализ обогащения выявил экспрессию большего количества миРНК из хромосом 19 и X ( Рисунок 1C и Дополнительный рисунок S1 ). Аналогичным образом, большее число экспрессий tRF наблюдалось на 4 хромосомах (т.е. 5, 7, 15 и 16; 9).0486 Рисунок 1D и Дополнительный рисунок S2 ), и piRNA из 6 хромосом (6, 9 15, 17, 19 и 22; Рисунок 1E и Дополнительный рисунок S3 ). Мы также отметили экспрессию miRNA и piRNA из Y-хромосомы. Анализ геномных аннотаций выявил обогащение экспрессии мнкРНК сперматозоидов в регуляторных областях генома и снижение экспрессии кодирующих экзонов. Большинство микроРНК происходило из UTR, в то время как tRF и piРНК преимущественно экспрессировались из CpG-богатых областей генома сперматозоидов (9).0486 Рисунок 1F ). Также наблюдалось увеличение экспрессии sncRNAs от промоторов (2 тыс. п.н. выше сайта начала транскрипции) и 2 тыс. п.н. ниже сайтов терминации транскрипции. Интроны показали небольшое увеличение экспрессии микроРНК, но в целом были истощены экспрессией tRF и piРНК.

Девяносто семь процентов tRF были получены из 5′-конца тРНК, включая 5′-tiR и 5′-tRF ( Supplemental File S2 ). Напротив, 3′-tiR, 3′-tRF и 1′-tRF были недостаточно представлены в сперме. Для каждого идентификатора tRF была извлечена наиболее распространенная геномная последовательность (имеющая наибольшее количество прочтений) и проведено сравнение в образцах до вмешательства, демонстрируя сохранение последовательности, а также длины в образцах. Около 80% наиболее распространенных последовательностей tRF были почти одинаковой длины (+-2 нуклеотида) в образцах. Наиболее распространенная последовательность была выбрана в качестве репрезентативной последовательности для tRF. ( Дополнительный файл S3 ).

422/2290 (18,4%) исходных piРНК были расположены внутри мобильных элементов (LINE:106, SINE:66, LTR:195, Satellites:3, Others:53), а 17/2290 (0,7%) произошли от тРНК ( Дополнительный файл S4 ). Мобильные элементы (TE), связанные с piRNA, состоят из элементов LINE, таких как L1, L2 и L3, элементов SINE, таких как семейство Alu, LTR, таких как ERV1, ERVL, ERVL-MaLR, Gypsy, транспозонов ДНК, таких как Tigger3b|ДНК|TcMar -Tigger и MER|DNA|hAT-Charlie и элементы-спутники ( Дополнительный файл S5) . 1041 из оставшихся исходных piРНК сопоставлены с генами, длинной межгенной некодирующей РНК (lincRNA) и псевдогенами (, дополнительный файл S5) . Мы обнаружили, что 234 гена, связанные с 1041 базовой piРНК, обогащены такими путями, как организация системы Гольджи и эндомембраны ( Supplemental Table S1 ) межиндивидуальные различия в профилях мнкРНК сперматозоидов субъектов в группе до вмешательства, мы изучили влияние возраста, ИМТ и показателей фертильности сперматозоидов, таких как концентрация сперматозоидов и подвижность сперматозоидов (9). 0486 Дополнительный файл S1 ). Было обнаружено, что экспрессия миРНК в значительной степени связана с возрастом и концентрацией сперматозоидов (значение p с поправкой на FDR <0,05, Supplemental File S6 ). Уровни экспрессии 56 миРНК (15 с повышенной экспрессией и 41 с пониженной регуляцией) менялись с возрастом (, рис. 2A(i) ), а 127 миРНК (57 с повышенной и 70 с пониженной регуляцией) — с концентрацией сперматозоидов (рис. ). 2А(ii)) . Чтобы установить гены-мишени микроРНК, связанные с возрастом и концентрацией сперматозоидов, были идентифицированы экспериментально подтвержденные и/или предсказанные мишени этих микроРНК с высокой оценкой. Анализ обогащения путей генов-мишеней с помощью основного анализа IPA (подробности в разделе «Методы») выявил, что возрастзависимые мишени микроРНК должны быть обогащены путями, которые, как известно, связаны со старением, такими как передача сигналов mTOR, передача сигналов апоптоза и p53, передача сигналов теломеразы, PI3K/ Передача сигналов AKT, передача сигналов Wnt/B-катенин и TGF-B ( Дополнительный рисунок S4 ). Аналогичным образом, гены-мишени для микроРНК, связанных с концентрацией сперматозоидов, были обогащены несколькими клеточными путями, в том числе связанными с мужской фертильностью и сперматогенезом, такими как передача сигналов андрогена, передача сигналов Сертоли и соединения зародышевых клеток, передача сигналов интегрина и протеинкиназы А (, дополнительная фигура S5) . Экспрессия tRF в сперме была в значительной степени связана с ИМТ и концентрацией сперматозоидов (значение p с поправкой на FDR <0,05). Шесть tRFs были подавлены у мужчин с высоким ИМТ (9).0486 Рисунок 2B(i) и Дополнительная таблица S2A ), а еще шесть tRF (3 с повышающей регуляцией и 3 с пониженной регуляцией) показали измененную экспрессию в связи с концентрацией сперматозоидов ( Рисунок 2B(ii) и Дополнительная таблица S2B ). Все 12 tRF были 5′-концевыми производными их соответствующих первичных тРНК. Экспрессия piРНК ассоциировалась только с концентрацией сперматозоидов, при этом 1 piРНК активировалась, а 2 подавлялась (, рисунок 2C, и , дополнительная таблица S2C, 9). 0487).

Рис. 2. sncRNA, связанная с возрастом, ИМТ и концентрацией сперматозоидов

(A) Графики Volcano, показывающие микроРНК, связанные с (i) возрастом и (ii) концентрацией сперматозоидов. На оси Y представлено скорректированное значение p-log10 связи между микроРНК и тестируемым отцовским фактором, а на оси X представлено кратное log2 изменение экспрессии микроРНК на единицу изменения возраста или концентрации сперматозоидов. Пунктирная горизонтальная линия представляет собой порог значимости (значение p с поправкой на FDR — log10 = 1,3) для анализа ассоциации. Зеленые точки выше этого порога представляют микроРНК, экспрессия которых значительно изменилась с возрастом и концентрацией сперматозоидов. Верхние микроРНК из обоих ассоциативных исследований помечены на соответствующих графиках вулканов. (B) Графики вулканов, показывающие tRF, связанные с (i) ИМТ и (ii) концентрацией сперматозоидов. Пунктирная горизонтальная линия представляет собой порог значимости (-log10 = 1,3) для анализа ассоциации, а фигуры синего цвета представляют различные подтипы tRF, экспрессия которых была значительно изменена в связи с ИМТ и концентрацией сперматозоидов. (C) Графики вулканов, показывающие piRNAs (розовые точки), связанные с концентрацией сперматозоидов. (D) Таблица, обобщающая количество подтипов sncRNAs, связанных с возрастом, ИМТ и концентрацией сперматозоидов.

Таким образом, концентрация сперматозоидов имела более общее влияние на различные подтипы sncRNA, в то время как возраст и ИМТ были связаны с изменениями в экспрессии miRNA и tRF, соответственно ( Рисунок 2D ). Эта прединтервенционная оценка индивидуальной изменчивости профилей sncRNA также помогла определить факторы, которые могли запутать анализ после вмешательства. Подвижность сперматозоидов не оказалась значимым фактором в нашем исследовании, но, поскольку ранее сообщалось, что она влияет на экспрессию sncRNA (Capra et al. 2017), мы включили ее в качестве дополнительной ковариации в последующий анализ.

Влияние диетического вмешательства на уровни витамина D и омега-3 жирных кислот в кровотоке

Для изучения влияния диетического вмешательства мы измерили уровни витамина D и омега-3 жирных кислот в образцах крови, собранных до и через 6 недель после -вмешательство. Чтобы также оценить погрешность выборки, показатели крови 17 субъектов, включенных в анализ мнкРНК, сравнивали с полным набором данных (N = 102) из ​​исследования PREPARE.

В полном наборе данных наблюдалось значительное увеличение (p-значение 1,9е ^-13 ; Рисунок 3A(i) ) концентрации витамина D в сыворотке участников группы вмешательства (среднее изменение = 83 нмоль/л) по сравнению с контрольной группой (среднее изменение = 2 нмоль/л). Подмножество образцов sncRNA также отражало ту же тенденцию (среднее изменение группы вмешательства = 109 нмоль/л, среднее изменение контрольной группы = 8 нмоль/л; значение p 9,9e ^-05 , Рисунок 3A(ii) ). Аналогичным образом, вмешательство в диету также показало значительное увеличение % EPA (полное значение p < 2,2e ^-16 и p-значение подмножества мнкРНК 2,7e ^-07 , Фигуры 3B (i и ii) ) и % DHA (полное множество p-значение < 2,2e ^-16 и p-значение подмножества sncRNA 9,6 e ^-06 ; и Фигуры 3C (i и ii) ) в эритроцитах как в полной субпопуляции, так и в субпопуляции sncRNA. Повышение уровня омега-3 жирных кислот и витамина D в кровотоке свидетельствует об эффективности 6-недельного диетического вмешательства. Мы также проверили, изменило ли вмешательство состав ЭПК и ДГК в семенной плазме и сперме. Процент EPA, измеренный в сперме (0,08 % (±1,57) против 0,06 % (±1,57), p = 0,007) и семенной плазме (0,12 % (±1,82) против 0,09).% (± 2,05), p = 0,032) был выше в группе лечения по сравнению с контрольной группой, однако не было замечено различий в процентном содержании DHA в сперме (15,43 % (± 2,64) против 13,85 % (± 1,89), p =0,379) или семенной плазмы (8,99% (±3,84) против 9,24% (±4,45), р=0,764). Поскольку физиологические изменения в уровнях жирных кислот не всегда должны отражаться в составе липидов спермы и спермы, эффекты измененного питания отца все же могут быть уловлены и переданы мужской зародышевой линии через эпигенетический путь.

Рисунок 3. Влияние диетического вмешательства на уровни витамина D и омега-3 жирных кислот в кровотоке (нмоль/л). Графики данных для (i) полного исследования (N = 102) и (ii) подмножества sncRNA (N = 17). (B) Диаграммы, сравнивающие изменение (до и после вмешательства) в % ЭПК состава эритроцитов субъектов в контрольной группе и группе вмешательства. Графики данных для (i) полного исследования и (ii) подмножества sncRNA. (C) Блочные диаграммы, сравнивающие изменения (до и после вмешательства) в % ДГК состава эритроцитов субъектов в контрольной группе и группе вмешательства. Графики данных для (i) полного исследования и (ii) подмножества sncRNA. (D) Относительное количество подтипов sncRNA после вмешательства.

Влияние диетического вмешательства на экспрессию sncRNA сперматозоидов

Затем мы изучили влияние диетического вмешательства на профиль sncRNA. Подобно составу sncRNA сперматозоидов до вмешательства, профили sncRNA после вмешательства также показали высокое содержание tRF, за которыми следовали miRNAs и piRNAs ( Figure 3D ), что указывает на отсутствие глобальных изменений в относительном количестве подтипов малых РНК. Однако мы идентифицировали по-разному экспрессируемые sncRNAs между контрольной и экспериментальной группами. Дополнительный файл S7 содержит список этих дифференциально экспрессируемых sncRNAs, обнаруженных после поправки на влияние возраста, ИМТ, концентрации и подвижности сперматозоидов.

Дифференциально экспрессируемые миРНК (DE-миРНК)

mirDeep2 использовали для характеристики профилей экспрессии миРНК сперматозоидов субъектов в контрольной и экспериментальной группах и идентификации DE-миРНК. Чтобы изучить специфические эффекты диеты, мы скорректировали анализ с учетом смешанных эффектов возраста, ИМТ, подвижности сперматозоидов и концентрации сперматозоидов. Было идентифицировано, что пятнадцать миРНК экспрессируются по-разному между контрольной и экспериментальной группами, с кратным изменением log2(1,5) и p-значением –log10 ≥ 2 (9).0486 Рисунки 4A и B, дополнительная таблица S3A и дополнительный файл S7 ). DIANA miRPath идентифицировала 7 из этих 15 микроРНК для генов-мишеней в путях биосинтеза и метаболизма жирных кислот (, рис. 4C, ). Например, для hsa-miR-506-3p были предсказаны сайты-мишени в 8 генах, а именно: ACAA2, ACSL1, CPT1A, ELOVL5, HADH, OXSM, PECR и SCD , за которыми следуют hsa-miR-513a-3p и hsa. -миР-513c-3p, нацеленная на 5 генов: ACADSB, ACOX1, ELOVL5, FASN, PTPLB ( Рисунок 4C ). Дополнительный IPA-анализ генов, на которые нацелены 7/15 DE-миРНК, подтвердил обогащение специфических путей, связанных с метаболизмом жирных кислот, таких как β-окисление жирных кислот, митохондриальный путь L-карнитина, биосинтез стеаратов, активация жирных кислот, γ- биосинтез линоленатов, биосинтез пальмитатов, инициирование биосинтеза жирных кислот и биосинтез олеатов (, рис. 4D, ). Помимо путей метаболизма жирных кислот, было обнаружено, что активация LXR/RXR, передача сигналов TGF-бета, передача сигналов Hippo и передача сигналов Wnt также значительно обогащены (9).0486 Дополнительная таблица S4 ).

Рисунок 4. Влияние диетического вмешательства на экспрессию миРНК

(A) Вулканический график, показывающий дифференциально экспрессируемые миРНК (вмешательство и контроль), выявленные после поправки на возраст, ИМТ, концентрацию сперматозоидов и их подвижность. Горизонтальная пунктирная линия представляет собой порог значимости ассоциации -log10 p = 2, а вертикальные пунктирные линии представляют кратное изменение log2(1,5). (B) Тепловая карта микроРНК, по-разному выраженных между контрольной и экспериментальной группами. Каждая строка представляет показатель z выражения для дифференциально экспрессируемого идентификатора микроРНК, указанного справа, изменение цвета с белого на красный указывает на величину увеличения экспрессии (активация), а изменение с белого на синий указывает на величину подавления. В каждом столбце представлены деидентифицированные идентификаторы субъектов, где те, которые начинаются с «C», относятся к субъектам в контрольной группе, а «I» относятся к субъектам в группе вмешательства. (C) Дифференциально экспрессируемые микроРНК и соответствующие им гены-мишени, предсказанные с помощью DIANA miRPath. Синий цвет (1) указывает на наличие взаимодействия микроРНК-мишень, а серый цвет (0) указывает на отсутствие предсказанного взаимодействия. (D) Анализ путей изобретательности (IPA) генов, на которые направлена ​​дифференциально экспрессируемая миРНК. Пути с наиболее представленными генами и обогащением -log10 p-value > 2 нанесены на график в порядке убывания значимости. Пунктирная красная линия представляет собой отношение генов-мишеней микроРНК к общему количеству генов, о которых известно, что они присутствуют в этом пути.

Дифференциально экспрессируемые tRF (DE-tRF)

Профилирование экспрессии фрагментов, полученных из тРНК (tRF), было выполнено с использованием конвейера анализа, разработанного Kumar et al. ., (Kumar et al. 2015). Была проведена количественная экспрессия 8 различных категорий tRF, полученных из тРНК (5’tir, tRF-5 (a/b/c), tRF-3 (a/b/c) и трейлеры тРНК (tRF-1)). После поправки на возраст, ИМТ, подвижность сперматозоидов и концентрацию сперматозоидов было обнаружено, что 3 tRF по-разному экспрессируются между экспериментальной и контрольной группами (кратное изменение log2(1,5) и p-значение –log10 ≥ 2; Рисунок 5A и B, дополнительный файл S7 и дополнительная таблица S3B) . Эти три дифференциально экспрессируемых tRF включали производные trf5b-2-TyrGTA, tir5-29-CysGCA и trf5b-24-AlaAGC.

Рисунок 5. Влияние диетического вмешательства на экспрессию tRF и piRNA

(A) Вулканический график, показывающий дифференциально экспрессируемые tRF (вмешательство и контроль), выявленные после поправки на возраст, ИМТ, концентрацию сперматозоидов и их подвижность. Горизонтальная пунктирная линия представляет собой порог значимости ассоциации -log10 p = 2, а вертикальные пунктирные линии представляют кратное изменение log2(1,5). (B) Тепловая карта tRFs, по-разному выраженных между контрольной и экспериментальной группами. (C) График вулкана, показывающий дифференциально выраженные piRNAs (вмешательство по сравнению с контролем). (D) Тепловая карта дифференциально экспрессируемых piRNA. Из-за ограничений по объему эта тепловая карта представлена ​​только для самых важных piRNA, отмеченных на рисунке 5 (C).

Дифференциально экспрессируемые пиРНК (DE-piРНК)

Анализ дифференциальной экспрессии piРНК с поправкой на возраст, ИМТ, подвижность сперматозоидов и концентрацию сперматозоидов выявил 112 piРНК (логарифмическое 2(1,5) кратное изменение и –log10 p-значение ≥ 2), которые различаются по выражение между экспериментальной и контрольной группами ( рис. 5C и D и дополнительный файл S7 ). 10,7% (12/112) этих DE-piРНК располагались внутри мобильных элементов (LINE:4, SINE:2, LTR:4, Others:2), а еще 48,2% (54/112) перекрывались с участками генома, кодирующими генов или LINC РНК ( Дополнительные файлы S8 и S9 ).

iDad_DB, база данных мнкРНК сперматозоидов с открытым исходным кодом

Для облегчения доступа, визуализации и будущего использования мнкРНК сперматозоидов, выявленных в этом исследовании, мы разработали базу данных открытого доступа под названием iDad_DB (https://idaddb. sics.karnanilab.com). /). Эта база данных содержит базовые, отцовские факторы и мнкРНК, чувствительные к диете, идентифицированные в этом исследовании.

Обсуждение

Эпигеном сперматозоидов чувствителен к образу жизни отца и окружающей среде и потенциально может передавать свои полезные или вредные эффекты будущему потомству. Это исследование обеспечивает картирование с высоким разрешением трех наиболее распространенных видов sncRNA (miRNAs, tRFs и piRNAs) в сперме человека, а также влияние здорового краткосрочного диетического вмешательства на их экспрессию. В экспериментальной группе исследования участникам давали диету, обогащенную витамином D и омега-3 жирными кислотами, известными своей противовоспалительной и благоприятной ролью в обмене веществ (Calder 2018). Несмотря на относительно короткую 6-недельную продолжительность вмешательства, наблюдалось значительное повышение уровня витамина D, ЭПК и ДГК в кровотоке и изменение профиля экспрессии мнкРНК сперматозоидов. В этом исследовании также был получен всеобъемлющий базовый ландшафт мнкРНК сперматозоидов человека и определены малые РНК, связанные с возрастом, ИМТ и качеством спермы. Наконец, мы разработали базу данных с открытым доступом, iDad_DB, для легкого доступа и будущего использования профилей мнкРНК сперматозоидов, созданных в исследовании.

Исходная характеристика ландшафта мнкРНК в сперме человека выявила множественные подтипы малых РНК с различным содержанием. Эти sncRNA преимущественно экспрессировались из регуляторных областей генома, таких как UTR. Сайты и промоторы, богатые CpG, предполагают их потенциальную роль в ремоделировании хроматина и регуляции транскрипции в сперматозоидах. Хотя количество уникальных tRF (143), экспрессируемых в сперме, было в 16 раз меньше, чем piRNA (2290), и в 2,8 раза меньше, чем miRNA (401), уровни их экспрессии были относительно высокими, что делает их наиболее распространенными sncRNA, экспрессируемыми в мужских гаметах. tRF5b и tRF5c были доминирующими производными тРНК, о которых ранее сообщалось, что они участвуют в эпигенетическом наследовании (Kumar et al. 2016). Мы также обнаружили формы tRF3a, b и c, которые не только имеют длину, сравнимую со зрелыми микроРНК, но также известно, что они функционируют подобно микроРНК и следуют сходным правилам связывания с мишенью. Наиболее высоко экспрессируемые tRF включают Gly-GCC, Glu-CTC, Glu-TTC, Val-CAC и His-GTG, которые, как сообщается, являются наиболее распространенными tRF в мышиных модельных системах (Chen et al. 2016; Sharma et al. 2016). Было показано, что tRF-Gly-GCC репрессирует экспрессию генов, регулируемых эндогенным ретроэлементом MERVL, в раннем развитии эмбриона. Наше исследование также выявило, что низкая экспрессия Gly-GCC связана с низкой концентрацией сперматозоидов, хотя мы также обнаружили 5 новых tRF, которые вносят свой вклад в эту связь. Ранее сообщалось, что среди дифференциально экспрессируемых tRFs Cys-GCA подавляется в модели мышей с высоким содержанием жиров (Chen et al. 2016).

Эффективность 6-недельного диетического вмешательства была очевидна по значительному увеличению уровня витамина D в сыворотке крови и процента ЭПК и ДГК в эритроцитах участников в группе вмешательства. Было обнаружено, что 7 из 15 дифференциально экспрессируемых микроРНК нацелены на гены, участвующие в биосинтезе и метаболизме жирных кислот, что демонстрирует потенциал диетического вмешательства для создания физиологических изменений, достаточных для того, чтобы передавать сигналы мужской зародышевой линии и быть эпигенетически захваченными изменениями в sncRNA. Около 18,4% (422/2290) исходных piРНК и 10,7% (12/112) индуцированных диетой piРНК экспрессировались из мобильных элементов (TE), таких как LINES, SINES и LTR. Поскольку одной из функций piRNAs является защита целостности генома во время сперматогенеза за счет молчания мобильных элементов, было обнаружено, что некоторые из них происходят непосредственно из транскриптов TE в смысловой ориентации. Также известно, что piRNAs обладают функциями, не связанными с TE, такими как регуляция экспрессии мРНК и lincRNA посредством посттранскрипционного молчания генов (Larriba and Del Mazo 2018). Мы обнаружили, что гены, связанные с базовыми piRNAs, обогащены такими путями, как организация системы Гольджи и эндомембраны. Поразительно, мы также обнаружили, что 17 исходных piRNAs произошли от tRNAs, что указывает на существование регулирующих взаимодействий между ними. Необходимы дальнейшие углубленные исследования для более глубокого понимания регуляции sncRNA сперматозоидов.

Это исследование имеет некоторые ограничения. Чтобы избежать ошибок небольшого размера выборки и обнаружения ложноположительных результатов, мы ограничили базовый анализ мнкРНК с высокой степенью достоверности, обнаруженными у всех 17 участников. Этот высокострогий анализ мог ограничить чувствительность обнаружения и пропустить некоторые sncRNAs. Кроме того, из-за ограниченной функциональной характеристики нижестоящих мишеней человеческих tRF мы не смогли отразить регуляторные результаты их измененной экспрессии при диетическом вмешательстве. Однако картирование tRF и piRNA с высоким разрешением, предпринятое в этом исследовании, выявило еще не известную сложность экспрессии их подтипов в сперме человека. Экспрессия подмножества piRNA из локуса tRNA также идентифицировала потенциальные перекрестные помехи между различными sncRNA, которые могут быть необходимы для эффективного улавливания эффектов внешнего воздействия на мужскую зародышевую линию.

В заключение следует отметить, что эпигенетическое программирование мужских гамет очень лабильно и чувствительно к изменениям образа жизни, например диеты. Эффекты кратковременного воздействия пищевых продуктов могут быть зафиксированы как «сигналы окружающей среды» в виде измененных профилей экспрессии sncRNA в мужской зародышевой линии и, вероятно, будут переданы следующему поколению, если эти изменения произойдут во время зачатия. Эти исследования показывают, что диета отца может иметь долгосрочные последствия для здоровья потомства, а потребление здоровой диеты в период до зачатия может помочь улучшить качество спермы за счет эпигенетического кодирования sncRNAs, оказывающего благотворное влияние на здоровье следующего поколения.

Методы

Информация о образцах и дизайн исследования

Исследование PREPARE представляет собой одноцентровое рандомизированное контролируемое исследование, в котором 111 мужчин и их партнеров, которым предстоит пройти курс ЭКО, предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании ( Кермак и др. , 2014). Этическое одобрение этого исследования было предоставлено региональным комитетом по этике исследований (13/SC/0544). Критерии исключения включали употребление жирной рыбы (по определению Агентства по пищевым стандартам Великобритании) чаще одного раза в неделю, ранее диагностированный диабет и любые медицинские противопоказания к приему пищевых добавок. Демографические данные мужчин и информация об их диете и физической активности были собраны по стандартной форме исследования во время набора, и был определен их ИМТ. Средний возраст участников составил 36 (± 5,5) лет, а средний ИМТ — 27,0 (± 4,0) кг/м 9 .0494 2 ( дополнительный файл S1 ). Участники исследования были рандомизированы в контрольную и интервенционную диетические группы. Группе вмешательства ежедневно давали напиток с пищевой добавкой на фруктовой основе, содержащий 2 грамма ДГК и ЭПК (1,2 г ДГК и 0,8 г ЭПК) и 10 мкг витамина D (Nutrifriend 2000, Smartfish, Осло, Норвегия), а также оливковое масло и оливковое масло. использовать как часть своего рациона, в то время как контрольная группа получала напиток плацебо (тот же напиток на фруктовой основе, но без омега-3 жирных кислот или витамина D (Smartfish, Осло, Норвегия)) и подсолнечное масло и спред на основе подсолнечного масла для использовать как часть своего рациона. Оливковое масло, подсолнечное масло и оба спреда были куплены в местном супермаркете и переупакованы для использования в исследовании. Напитки, масла и спреды поставлялись в немаркированных контейнерах, и испытание было двойным слепым. Продолжительность вмешательства составила 6 недель. 102 участника завершили испытание, и у них были взяты образцы спермы как во время визитов до, так и после вмешательства. Профилирование sncRNAseq было выполнено на подмножестве этих участников (N = 17; 9из контрольной группы и 8 из группы вмешательства) (, рис. 1А, ).

Анализ спермы

Анализ спермы был выполнен слепым андрологом для всех образцов в соответствии с рекомендациями ВОЗ (Cooper and Castilla 2009). разжижение пробы и вязкость; объем произведенной спермы; концентрация сперматозоидов; процент подвижных и прогрессивно подвижных сперматозоидов; регистрировали процент сперматозоидов с нормальной морфологией. Образец считался нормальным, если было произведено не менее 1,5 мл спермы; он разжижался в течение одного часа и не был вязким; и он имел не менее 15 миллионов сперматозоидов на мл эякулята с прогрессивной подвижностью не менее 32% и нормальной морфологией не менее 4%.

Сперму (2 мл или максимально доступный объем, если он меньше) помещали в градиент плотности (созданный с использованием 1 мл 90% раствора Nidacon PureSperm®100, поверх которого наложен 1 мл 45% раствора Nicadon PureSperm®100) и центрифугировали при 400 г в течение 20 минут для отделения семенной плазмы от сперматозоидов. Супернатант (семенную плазму) удаляли и хранили аликвотами по 1 мл при -80°С. Осадок спермы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и центрифугировали при 400 g в течение еще 5 минут, этот осадок спермы собирали и хранили при -80°C до анализа. Для анализа фрагментации ДНК сперму оставляли для разжижения не менее чем на 30 минут после эякуляции. Затем от 100 мкл до 200 мкл помещали в пробирку и погружали в жидкий азот для быстрой заморозки, а затем хранили при -80°C до проведения анализа. Фрагментацию ДНК сперматозоидов оценивали с помощью анализа SpermComet, теста ДНК сперматозоидов второго поколения (Lewis et al. 2013).

Забор крови

Кровь собирали в пробирки для разделения литий-гепарина и сыворотки во время набора и в день забора ооцитов партнера. Кровь, собранную в литий-гепарин, центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут при 20°C. Плазму удаляли, осадок эритроцитов промывали в PBS и центрифугировали при 400 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Стадию промывки повторяли дважды. Затем осадок эритроцитов хранили в виде аликвоты по 0,5 мл при -80°C до анализа жирных кислот. Кровь, собранную в SST, перемешивали и центрифугировали при 1500 g в течение 10 минут. Супернатант (сыворотку) удаляли и хранили аликвотами при -80°C до анализа на витамин D.

Анализ жирных кислот

Анализ жирных кислот проводили на эритроцитах, семенной плазме и сперме. Во всех случаях общий липид экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1, об./об.). Липидный экстракт нагревали до 50°С в течение 2 часов с 2% метанола в серной кислоте для получения метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК). МЭЖК были разделены и идентифицированы с помощью газовой хроматографии, выполненной в соответствии с условиями, описанными в другом месте (Fisk et al. 2014). МЭЖК идентифицировали путем сравнения времени работы со временем работы аутентичных стандартов. Концентрации жирных кислот выражены в % от общего количества присутствующих жирных кислот. Анализ спермы выполняли только в том случае, если концентрация сперматозоидов превышала 15 миллионов на мл и после клинического использования в день забора ооцитов оставалось достаточное количество спермы.

Анализ витамина D

Концентрации витамина D в сыворотке определяли с помощью жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США) в лаборатории химической патологии Университетской больницы Саутгемптона NHS Foundation Trust, члена схемы EQA витамина D (ДЕКАС).

Обработка образцов спермы и выделение РНК

Суммарная РНК, включая мнкРНК, была выделена из замороженных гранул спермы с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, UK) с модифицированным протоколом, адаптированным от Goodrich, et al. ., (Goodrich et al. 2013), который был оптимизирован для выделения РНК сперматозоидов. Вкратце, гранулы спермы оттаивали, смешивали с Qiazol (Qiagen, UK) и разрушали вручную. Добавляли хлороформ, образцы инкубировали (комнатная температура в течение 5 минут) и центрифугировали (12000 ×g ) в течение 20 минут. Верхний водный слой удаляли и смешивали с этанолом. Образцы добавляли в спин-колонки micro RNeasy (Qiagen, Великобритания) и центрифугировали в течение 15 секунд (8000 x g ). Спин-колонки промывали с использованием поставляемых буферов и этанола. Образцы переносили в пробирки для сбора без РНКазы и элюировали тотальную РНК. Концентрации РНК определяли количественно с использованием Qubit total и microRNA assays (Thermo Fisher, UK), РНК быстро замораживали на сухом льду и хранили при температуре -80 градусов.

Секвенирование мнкРНК

Образцы РНК сперматозоидов были отобраны как из контрольной группы, так и из группы диетического вмешательства на основе количества РНК после экстракции (n=17). 10 мкл РНК использовали для выполнения секвенирования малых РНК (около 15 миллионов прочтений) с использованием рабочего процесса малых РНК (Oxford Genomics, OGC). В соответствии с инструкциями производителя использовали набор для подготовки библиотеки малых РНК NEBNext для Illumina (E7330). Вкратце, проводили лигирование 3’-адаптера SR с последующей гибридизацией RT-праймера с мРНК. Затем лигировали денатурированный 5′-адаптер SR и проводили обратную транскрипцию первой цепи кДНК. После синтеза второй цепи с индексированными (на основе TruSeq одноиндексированными i7) и P5 праймерами двухцепочечную ДНК затем очищали с использованием гранул Ampere XP, а библиотеки отбирали по размеру с помощью Pippin (125-160 п.н.). Концентрацию библиотек малых РНК определяли с помощью Picogreen перед мультиплексированием для секвенирования. Окончательное распределение объединенной библиотеки по размерам определяли с помощью Agilent Tapestation и количественно определяли с помощью Qubit (Thermofisher, Великобритания) перед секвенированием на HiSeq2500 (Illumina, Великобритания) (2X прогоны) в виде одиночных чтений 50 п.н. Данные были приведены в соответствие с эталонным геномом и сгенерированы файлы FASTQ.

Обработка данных секвенирования мнкРНК

FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) использовали для проверки качества (КК) ридов секвенирования. Все образцы прошли средний балл качества по базовой последовательности ≥30. Средняя длина секвенированных прочтений составила 51 нуклеотид, включая адаптеры. Trimmomatic 0,38 (Bolger et al. 2014) использовали для удаления последовательностей адаптера, а считывания последовательностей <10 нуклеотидов исключали из последующего анализа. Для профилирования и оценки относительного количества подтипов sncRNA использовался конвейер анализа exceRpt small RNA-seq, доступный в рабочей среде Genboree (https://www. genboree.org/site/). Поскольку текущая версия Genboree не включает последний выпуск для баз данных miRNA и tRF, мы дополнительно использовали специальные инструменты аннотатора, чтобы сообщить об окончательных результатах. Модули Mapper.pl и quantifier.pl инструмента miRDeep2 (Friedlander et al. 2012) и последний выпуск miRBase (http://mirbase.org/) 22 использовались для аннотирования и количественной оценки известной микроРНК человека.

Следующие параметры были использованы для модуля отображения и квантификатора, взяв образец 005mv1-249 в качестве примера:

устройство отображения . пл 005мв1-249-трим . fastq -e -g 249 -h -i -j -l 15 -m -s 005mv1-249-trim-col . квантификатор fa –v . pl-p hsa-предшественник-миРНК-R22 . fa-m hsa-mature-miRNAs-R22 . fa -r 005mv1-249-trim-col . fa -t hsa

Для анализа тРФ последовательности тРНК человека загружали из базы данных тРНК (http://gtrnadb. ucsc.edu/). Для каждого гена тРНК последовательности ДНК, выделенные из генома, включали дополнительные 100 оснований выше и 200 оснований ниже зрелой тРНК. Поскольку «CCA» добавляется к 3’-концу тРНК с помощью тРНК-нуклеотидилтрансферазы во время процесса созревания тРНК, эта триплетная нуклеотидная последовательность также была включена в 3’-конец выделенных последовательностей ДНК, чтобы избежать несоответствия последовательностей в процессе картирования. Затем риды секвенирования мнкРНК сперматозоидов картировали с выделенной последовательностью тРНК с помощью инструмента BLASTn. Выравнивания последовательностей с несовпадением ≤1 нуклеотида сохраняли для последующего анализа. Выходной файл blast был проанализирован, чтобы получить информацию о картированном положении малых РНК в генах тРНК и разделить последовательности на определенные подтипы: 5′ tiRs, 5′ (a, b, c), 3′ (a, b, c). ) и 1-трФС.

Для анализа экспрессии piРНК использовалась платформа Genboree для количественного определения и профиля человеческих piРНК из банка piRNABank.

Ассоциация sncRNA с отцовскими факторами

Для базовой характеристики sncRNA необработанные чтения QCed были обработаны для получения значений экспрессии в отсчетах на миллион (имп/мин). sncRNA с числом импульсов в минуту ≥1 у всех 17 субъектов в группе до вмешательства были сохранены и нормализованы с использованием метода Trimmed Mean of M (TMM). Нормализованные данные затем подвергались обработке с преобразованием весов качества конкретных образцов для уменьшения веса образцов с выбросами. Пакет Limma Bioconductor (Ritchie et al. 2015) использовался для анализа ассоциации исходного уровня мнкРНК с отцовскими факторами, такими как возраст, ИМТ, потребление алкоголя/кофеина и качество спермы. Умеренная t-статистика ассоциации была рассчитана эмпирическим байесовским методом (eBayes) с использованием подбора линейной модели (Lmfit). Ассоциации со значением p <0,05 с поправкой на FDR были зарегистрированы как значительные изменения в ответ на единичное изменение оцененного отцовского фактора.

Дифференциальная экспрессия sncRNA между контрольной и экспериментальной группами

Дифференциально экспрессируемая sncRNA между контрольной и экспериментальной группами была проанализирована с использованием пакета Limma Bioconductor (Ritchie et al. 2015). sncRNAs, которые имели cpm ≥1, по крайней мере, в 8 образцах в каждой группе, сохраняли и нормализовали с использованием метода Trimmed Mean of M (TMM). Нормализованные данные были подвергнуты двойному объему с преобразованием весов качества конкретных образцов для уменьшения веса образцов с выбросами. Поскольку образцы были собраны в двух точках времени от одного и того же человека, был проведен парный анализ с использованием метода дублирующей корреляции Лиммы и блокировки ID. Этот анализ был скорректирован с учетом смешанных эффектов возраста, ИМТ, концентрации и подвижности сперматозоидов. Умеренная t-статистика дифференциального выражения была рассчитана эмпирическим байесовским методом (eBayes) с использованием подбора линейной модели (Lmfit) и сравнением общего эффекта вмешательства по сравнению с контролем с использованием следующего уравнения: (Вмешательство. T2 — Вмешательство.T1) — ( Контроль.Т2 — Контроль.Т1), где Т2 — момент времени после 6 недель вмешательства, а Т1 — момент времени первого визита. Поскольку ни одна из sncRNA не прошла скорректированное по FDR p-значение ≤ 0,05, мы сообщили о sncRNA, которая прошла нескорректированное отсечение p-значения ≤ 0,01 и log2 (1,5) кратное изменение.

Определение биологической значимости sncRNAs

Информация о мишенях микроРНК и обогащение пути с использованием DIANA miRPath и IPA

программный пакет, в котором используются предсказанные мишени микроРНК, предоставленные алгоритмом DIANA-microT-CDS, или экспериментально подтвержденные взаимодействия микроРНК-мишень, полученные из DIANA-TarBase. Эти предсказанные и/или экспериментально подтвержденные мишени впоследствии используются для анализа KEGG и Gene Ontology. Этот программный пакет использовали для оценки генов-мишеней микроРНК и связанных с ними функциональных путей.

В дополнение к DIANA-mirPath мы также использовали IPA (QIAGEN Inc. , https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis) для оценки функциональной роли микроРНК. Этот инструмент извлекает информацию о целевых микроРНК из таких баз данных, как TarBase, miRecords и TargetScan. Экспериментально известные, а также мишени с высокой достоверностью (высокая оценка) были отфильтрованы, и гены, на которые нацелены ≥2 микроРНК, были использованы для основного анализа в IPA, который сообщает о значительно обогащенных путях. Пороговое значение -log10 p, равное 2, использовалось для сообщения о путях, в которых гены-мишени были значительно обогащены.

Определение мишеней базовых и дифференциально экспрессируемых piРНК

Для определения функциональной аннотации piРНК, идентифицированных в этом исследовании, использовались два подхода. Первый подход включал аннотацию геномных координат DE-piРНК и исходных piРНК с использованием программы annotatePeaks.pl в пакете программного обеспечения для анализа мотивов Homer (http://homer.ucsd. edu/homer/). Второй подход включал сравнение piRNAs (piRNABank) (Sai ​​Lakshmi and Agrawal, 2008) с базой данных piRBase (Wang et al., 2019).), который содержит информацию о связанных с повторами и связанных с генами piРНК.

Доступ к данным

Все необработанные и обработанные данные секвенирования мнкРНК, полученные в этом исследовании, были представлены в NCBI Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под инвентарным номером. GSE159752. Из-за этических соображений подтверждающие клинические данные не могут быть размещены в открытом доступе. Тем не менее, исследовательская группа PREPARE может предоставить данные по запросу при условии соответствующего одобрения после подачи официального заявления в Группу надзора за исследованием PREPARE через соответствующего автора.

Конкурирующие интересы

NK, KMG, KAL и YSC являются частью академического консорциума, который получил финансирование исследований от Abbott Nutrition, Nestec, BenevolentAI Bio Ltd. и Danone. PCC входит в состав Научно-консультативного совета Smartfish, производителя напитков, используемых в исследовании. PCC получил гонорары за консультации и/или выступления от Fresenius-Kabi, B. Braun, Baxter Healthcare, Abbott Nutrition и Danone/Nutricia, продавцов парентеральных и энтеральных кормов, а также от Pronova BioPharma/BASF AS и Smartfish, продавцов продуктов, содержащих омега-3 жирные кислоты. КМГ получил компенсацию за выступления на конференциях, спонсируемых компаниями, реализующими продукты питания. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Регистрационный номер исследования: ISRCTN50956936

Дата регистрации исследования: 02.10.2014

Вклад авторов

NK, KAL и KMG разработали концепцию исследования, а NK и KAL руководили исследованием sncRNA в Сингапуре и Великобритании, соответственно. AJK, PCC, FDH и NSM разработали исследование PREPARE, AJK, KD и SJW внесли вклад в сбор проб и данных, а TPXY, HLF и SL в анализ проб. MB обрабатывал образцы спермы для выделения РНК и секвенирования мнкРНК, CV, PFT, PK, AD и NK обрабатывал, анализировал и интерпретировал данные секвенирования мнкРНК. CV, PK, KAL, KMG, MB и NK внесли свой вклад в написание первоначального проекта рукописи. JH, CV, PFT и NK разработали базу данных iDad_db. Все авторы критически рассмотрели рукопись на предмет интеллектуального и научного содержания и одобрили окончательный вариант рукописи.

Дополнительные рисунки и подписи к таблицам

Дополнительный рисунок S1. Хромосомный анализ обогащения исходных микроРНК в сперме . Горизонтальные пунктирные линии обозначают пороговые значения z-показателя для избыточного (≥ 2) и недостаточного (≤ -2) представительства миРНК.

Дополнительный рисунок S2. Хромосомный анализ обогащения базовых tRF в сперме . Горизонтальные пунктирные линии обозначают пороговые значения z-показателя для избыточного (≥ 2) и недостаточного (≤ -2) представления tRF.

Дополнительный рисунок S3. Хромосомный анализ обогащения исходных piРНК в сперме . Горизонтальные пунктирные линии обозначают пороговые значения z-показателя для избыточного (≥ 2) и недостаточного (≤ -2) представления piRNA

Дополнительный рисунок S4. Анализ обогащения пути на основе IPA генов-мишеней miRNA, связанных с возрастом .

Фиолетовым цветом отмечены известные генные пути, связанные со старением. Пунктирная красная линия представляет собой отношение генов-мишеней микроРНК к общему количеству генов, о которых известно, что они присутствуют в этом пути.

Дополнительный рисунок S5. Анализ обогащения пути на основе IPA генов-мишеней miRNA, связанных с концентрацией сперматозоидов .

Фиолетовым цветом отмечены известные генные пути, связанные с концентрацией сперматозоидов. Пунктирная красная линия представляет собой отношение генов-мишеней микроРНК к общему количеству генов, о которых известно, что они присутствуют в этом пути.

Дополнительная таблица S1: 10 основных путей (значение FDR q <0,05), обогащенных 234 генами, связанными с исходной piRNA, перечисленными в дополнительном файле S5, лист 6.

Дополнительная таблица S2 . Исходные tRF и piRNA, связанные с ИМТ и концентрацией сперматозоидов при скорректированном значении p -log10 ≥ 1,3

Дополнительная таблица S3. Диетическое вмешательство вызывало изменения в экспрессии sncRNA

(A) Дифференциально экспрессируемые микроРНК (вмешательство и контроль), идентифицированные путем сравнения профиля экспрессии микроРНК, полученного из miRDeep2. Этот анализ был скорректирован с учетом возраста, ИМТ, концентрации сперматозоидов и подвижности сперматозоидов. Сообщается о микроРНК с кратным изменением ≥ log2 (1,5) и нескорректированным значением p-log10 ≥2.

(B) Дифференциально экспрессируемые tRF, идентифицированные после поправки на возраст, ИМТ, концентрацию сперматозоидов и подвижность сперматозоидов с использованием отсечки кратного изменения log2(1,5) и нескорректированного значения p-log10 ≥2.

Дополнительная таблица S4. Анализ путей генов-мишеней микроРНК, измененных диетическим вмешательством .

(A) Генные пути, идентифицированные с помощью программного обеспечения DIANA mirPath, при скорректированном FDR значении p <0,05.

(B) Целевые прогнозные баллы mirPath micro-T CDS для 7 DE-миРНК, нацеленных на гены метаболизма жирных кислот.

Дополнительные файлы

Дополнительные файлы S1. Характеристики и демографические данные субъектов, анализ спермы, анализ спермы и показатели крови участников исследования

Лист 1: подмножество мнкРНК (N=17) до вмешательства

Лист 2: Полный набор (N=102) до вмешательства

Лист 3: субнабор мнкРНК (N=17) после вмешательства

Лист 4: Полный набор (N=102) после вмешательства

Дополнительный файл S2. Исходная характеристика ландшафта мнкРНК до вмешательства

Лист 1: Профиль экспрессии 401 зрелой миРНК

Лист 2: Профиль экспрессии 143 tRF

Лист 3: Профиль экспрессии 2290 piРНК

Дополнительный файл S3. Базовые последовательности tRF, присутствующие в образцах до вмешательства

Лист 1: Наиболее распространенная последовательность для каждого идентификатора tRF в 17 образцах.

Лист 2: Репрезентативная последовательность tRF для каждого идентификатора tRF

Дополнительный файл S4. Аннотация Гомера всех геномных местоположений исходных piРНК

Лист 1: Базовый уровень piРНК, перекрывающихся с мобильными элементами (TE)

Лист 2: Базовый уровень piRNA, перекрывающийся с тРНК

Лист 3: Базовый уровень piRNA, не перекрывающийся с мобильными элементами (NTE)

Дополнительный файл S5. Сопоставление базового уровня piRNA, идентифицированного piRNABank, с аннотациями piRBase

Лист 1: Идентификаторы piRNA piRNABank, сопоставленные с piRBase

Лист 2: Базовые piРНК, родственные LINE в piRBase

Лист 3: Родственные SINE базовые piРНК в piRBase

Лист 4: Связанные с LTR базовые piРНК в piRBase

Лист 5: Связанные со спутниками базовые piРНК в piRBase

Лист 6: Связанные с генами базовые piРНК в piRBase

Дополнительный файл S6. микроРНК, связанные с возрастом и концентрацией сперматозоидов

Лист 1: микроРНК, связанные с возрастом (скорректированное значение –log10 p ≥ 1,3)

Лист 2: микроРНК, связанные с концентрацией сперматозоидов (скорректированное значение –log10 p ≥ 1,3)

Дополнительный файл С7. Дифференциально экспрессируемая sncRNA между контролем и вмешательством мнкРНК, выделенные фиолетовым цветом, представляют собой DE-мягкую РНК, идентифицированную после поправки на влияние возраста, ИМТ, концентрации и подвижности сперматозоидов.

Лист 1: Дифференциально экспрессируемая микроРНК (нескорректированное значение –log10 p ≥ 2).

Лист 2: Дифференциально выраженный tRF (нескорректированное значение –log10 p ≥ 2).

Лист 3: Дифференциально экспрессируемая пиРНК (нескорректированное значение –log10 p ≥ 2).

Дополнительный файл S8: аннотация Гомера всех геномных местоположений DE-piRNAs

Лист 1: DE-piРНК, перекрывающиеся с мобильными элементами (TE)

Лист 2: DE-piRNA, не перекрывающиеся с мобильными элементами (NTE)

Дополнительный файл S9: Сопоставление piRNABank идентифицированных DE-piRNA с аннотациями piRBase

Лист 1: Идентификаторы piRNA piRNABank, картированные с помощью piRBase.

Лист 2: Родственные повторы DE-piRNAs в piRBase

Лист 3: Гены родственные DE-piRNAs в piRBase

Благодарности

Мы хотим поблагодарить участников исследования из Complete Fertility, Саутгемптон, за то, что они сделали этот проект возможным, а также сотрудников учреждений за помощь в управлении проектом. Анализ мнкРНК спермы финансировался начальными фондами EpiGen Global Research Consortium Seed Funds, доступными для NK и KAL. Дополнительные средства для анализа данных мнкРНК в Сингапуре были поддержаны Фондом стратегического позиционирования и фондами IAFpp (h27/01/a0/005), доступными для NK через Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR), Сингапур (номер награды SPF 002). /2013). Мы также благодарим Оксфордский центр геномики в Центре генетики человека Wellcome (финансируется ссылкой на грант Wellcome Trust 203141/Z/16/Z) за создание данных секвенирования. Исследование PREPARE финансировалось Саутгемптонским биомедицинским исследовательским центром NIHR. Напитки (как интервенционные, так и контрольные) были разработаны, изготовлены и поставлены компанией Smartfish. КМГ поддерживается Советом по медицинским исследованиям Великобритании (MC_UU_20/4), Национальным институтом старения США при Национальных институтах здравоохранения (номер награды U24AG047867), Советом по экономическим и социальным исследованиям Великобритании и Исследовательским советом по биотехнологии и биологическим наукам (награда номер ES/M0099X/), Национальный институт медицинских исследований (в качестве старшего исследователя NIHR (NF-SI-055–0042) и через Саутгемптонский центр биомедицинских исследований NIHR), Британский кардиологический фонд (RG/15/17/3174) и Программа Европейского Союза Erasmus□+□Повышение потенциала (ImpENSA, номер соглашения о предоставлении гранта 598488-EPP-1-2018-1-DE-EPPKA2-CBHE-JP). KAL поддерживается British Heart Foundation (RG/15/17/3174), Diabetes UK (16/0005454). Финансирующие органы не участвовали в разработке, сборе, анализе и интерпретации данных, написании статьи или принятии решения о подаче на публикацию.

Сноски

Ссылки

1. ↵

   Bedi Y, Chang RC, Gibbs R, Clement TM, Golding MC. 2019. Изменения в некодирующих РНК, унаследованных от сперматозоидов, связаны с ограничением роста плода на поздних сроках, вызванным употреблением алкоголя отцом до зачатия. Reprod Toxicol 87: 11–20.

2. ↵

   Беликард Т., Джареозеттасин П., Саркис П. 2018. Путь piRNA реагирует на сигналы окружающей среды, чтобы установить межпоколенческую адаптацию к стрессу. BMC Biol 16: 103.

3. ↵

   Bolger AM, Lohse M, Usadel B. 2014. Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательностей Illumina. Биоинформатика 30: 2114–2120.

4. ↵

   Колдер ПК. 2018. Жирные кислоты n-3 с очень длинной цепью и здоровье человека: правда, вымысел и будущее. Proc Nutr Soc 77: 52–72.

5. ↵

   Capra E, Turri F, Lazzari B, Cremonesi P, Gliozzi TM, Fojadelli I, Stella A, Pizzi F. 2017. Секвенирование малых РНК криоконсервированной спермы одного быка выявило измененную экспрессию miRNAs и piRNAs между High — и малоподвижные популяции сперматозоидов. BMC Genomics 18: 14.

6. ↵

   Carone BR, Fauquier L, Habib N, Shea JM, Hart CE, Li R, Bock C, Li C, Gu H, Zamore PD et al. 2010. Индуцированное отцом трансгенерационное перепрограммирование экспрессии метаболических генов у млекопитающих. Мобильный 143: 1084–1096.

7. ↵

   Chen Q, Yan M, Cao Z, Li X, Zhang Y, Shi J, Feng GH, Peng H, Zhang X, Zhang Y и др. 2016. ЦРНК сперматозоидов способствуют межпоколенческому наследованию приобретенного нарушения обмена веществ. Наука 351: 397–400.

8. ↵

   Cole C, Sobala A, Lu C, Thatcher SR, Bowman A, Brown JW, Green PJ, Barton GJ, Hutvagner G. РНК, полученные из тРНК. РНК 15: 2147–2160.

9. ↵

   Cooper T, Castilla JA. 2009. ЛАБОРАТОРНОЕ РУКОВОДСТВО ВОЗ ПО ИССЛЕДОВАНИЮ И ОБРАБОТКЕ СЕМЕНИ ЧЕЛОВЕКА .

10. ↵

    Крюс Д., Джиллетт Р., Скарпино С.В., Маниккам М., Савенкова М.И., Скиннер М.К. 2012. Эпигенетическое трансгенерационное наследование измененных реакций на стресс. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 9143–9148.

11. ↵

    Чеш Б., Хэннон Г.Дж. 2016. Один цикл, чтобы править ими всеми: цикл пинг-понга и молчание, управляемое piRNA. Trends Biochem Sci 41: 324–337.

12. ↵

    Дэн З., Чен Ф., Чжан М., Лан Л., Цяо З., Цуй И., Ан Дж., Ван Н., Фан З., Чжао Х и др. 2016. Связь между загрязнением воздуха и качеством спермы: систематический обзор и метаанализ. Загрязнение окружающей среды 208: 663–669.

13. ↵

    Донкин И., Баррес Р. 2018. Эпигенетика сперматозоидов и влияние факторов окружающей среды. Мол Метаб 14: 1–11.

14. ↵

    Ernst C, Odom DT, Kutter C. 2017. Появление piRNAs против инвазии транспозонов для сохранения целостности генома млекопитающих. Nat Commun 8: 1411.

15. ↵

    Fisk HL, West AL, Childs CE, Burdge GC, Calder PC. 2014. Использование газовой хроматографии для анализа изменения состава жирных кислот в ткани печени крыс во время беременности. J Vis Exp doi: 10.3791/51445.

16. ↵

    Флеминг Т.П., Уоткинс А.Дж., Веласкес М.А., Мазерс Дж.К., Прентис А.М., Стефенсон Дж., Баркер М., Саффери Р., Яйник С.С., Экерт Дж.Дж. и др. 2018. Истоки здоровья на протяжении всей жизни во время зачатия: причины и последствия. Ланцет 391: 1842–1852.

17. ↵

    Friedlander MR, Mackowiak SD, Li N, Chen W, Rajewsky N. 2012. miRDeep2 точно идентифицирует известные и сотни новых генов микроРНК в семи группах животных. Nucleic Acids Res 40: 37–52.

18. ↵

    Fullston T, Ohlsson Teague EM, Palmer NO, DeBlasio MJ, Mitchell M, Corbett M, Print CG, Owens JA, Lane M. 2013. Отцовское ожирение вызывает метаболические нарушения у двух поколений мышей с неполной пенетрантностью. к поколению F2 и изменяет транскрипционный профиль содержания микроРНК семенников и сперматозоидов. FASEB J 27: 4226–4243.

19. ↵

    Гапп К., Джаваид А., Саркис П., Бохачек Дж., Пелчар П., Прадос Дж., Фаринелли Л., Миска Э., Мансуй И.М. 2014. Участие РНК сперматозоидов в трансгенерационном наследовании последствий ранней травмы у мышей. Nat Neurosci 17: 667–669.

20. ↵

    Гудрич Р.Дж., Антон Э., Кравец С.А. 2013. Выделение мРНК и малых некодирующих РНК из спермы человека. Методы Mol Biol 927: 385–396.

21. ↵

    Grandjean V, Fourre S, De Abreu DA, Derieppe MA, Remy JJ, Rassoulzadegan M. 2015. РНК-опосредованная отцовская наследственность диетического ожирения и метаболических нарушений. Научный представитель 5: 18193.

22. ↵

    Грубер А. Дж., Заволан М. 2013. Модуляция эпигенетических регуляторов и решение клеточных судеб микроРНК. Эпигеномика 5: 671–683.

23. ↵

    Хауссекер Д., Хуанг Ю., Лау А., Парамесваран П., Файр А.З., Кей М.А. 2010. Малые РНК, полученные из тРНК человека, в глобальной регуляции сайленсинга РНК. РНК 16: 673–695.

24. ↵

    Кермак А.Дж., Колдер П.С., Хоутон Ф.Д., Годфри К.М., Маклон Н.С. 2014. Рандомизированное контролируемое исследование диетического вмешательства до зачатия у женщин, проходящих ЭКО (исследование PREPARE). BMC Womens Health 14: 130.

25. ↵

    Кумар П., Куску С., Датта А. 2016. Биогенез и функция фрагментов, связанных с транспортной РНК (tRF). Trends Biochem Sci 41: 679–689.

26. ↵

    Кумар П., Мудунури С.Б., Анайя Дж., Датта А. 2015. tRFdb: база данных для переноса фрагментов РНК. Nucleic Acids Res 43: D141–145.

27. ↵

    Larriba E, Del Mazo J. 2018. Интегративный анализ piRNA гамет и зигот мыши выявляет новое потенциальное происхождение и регулирующие роли генов. Sci Rep 8: 12832.

28. ↵

    Lee YS, Shibata Y, Malhotra A, Dutta A. 2009. Новый класс малых РНК: фрагменты РНК, полученные из тРНК (tRF). Гены Дев 23: 2639–2649.

29. ↵

    Льюис С.Э., Джон Эйткен Р., Коннер С.Дж., Юлиис Г.Д., Эвенсон Д.П., Хенкель Р., Гиверкман А., Гарагозлоо П. 2013. Влияние повреждения ДНК сперматозоидов при вспомогательном зачатии и за его пределами: последние достижения в диагностике и лечение. Репрод Биомед Онлайн 27: 325–337.

30. ↵

    Маниккам М., Трейси Р., Герреро-Босанья С., Скиннер М.К. 2012. Смесь пестицидов и средств от насекомых (перметрин и ДЭТА) вызывает эпигенетическое трансгенерационное наследование болезней и эпимутации сперматозоидов. Reprod Toxicol 34: 708–719.

31. ↵

    Маниккам М., Трейси Р., Герреро-Босанья С., Скиннер М.К. 2013. Произведенные из пластика эндокринные разрушители (BPA, DEHP и DBP) вызывают эпигенетическое трансгенерационное наследование ожирения, репродуктивных заболеваний и эпимутаций сперматозоидов. PLoS One 8: e55387.

32. ↵

    Маккрири Дж.К., Труика Л.С., Фризен Б., Яо Ю., Олсон Д.М., Ковальчук И., Кросс А.Р., Мец Г.А. 2016. Измененная морфология мозга и функциональная связность отражают уязвимое аффективное состояние после кумулятивного стресса нескольких поколений у крыс. Неврология 330: 79–89.

33. ↵

    Натт Д., Кугельберг У., Касас Э., Недстранд Э., Залавари С., Хенрикссон П., Нийм С., Ядерквист Дж., Сандборг Дж., Флинке Э. и др. 2019. Человеческая сперма быстро реагирует на диету. PLoS Биол 17: e3000559.

34. ↵

    Ng SF, Lin RC, Laybutt DR, Barres R, Owens JA, Morris MJ. 2010. Хроническая диета с высоким содержанием жиров у отцов программирует дисфункцию бета-клеток у потомства самок крыс. Природа 467: 963–966.

35. ↵

    Ng SF, Lin RC, Maloney CA, Youngson NA, Owens JA, Morris MJ. 2014. Потребление отцовской диеты с высоким содержанием жиров вызывает общие изменения в транскриптомах забрюшинной жировой ткани и тканей островков поджелудочной железы у потомства самок крыс. FASEB J 28: 1830–1841.

36. ↵

    Peng H, Shi J, Zhang Y, Zhang H, Liao S, Li W, Lei L, Han C, Ning L, Cao Y et al. 2012. Новый класс малых РНК, полученных из тРНК, чрезвычайно обогащен спермой зрелых мышей. Cell Res 22: 1609–1612.

37. ↵

    Ричи М.Э., Фипсон Б., Ву Д., Ху И, Лоу К.В., Ши В., Смит Г.К. 2015. limma обеспечивает анализ дифференциальной экспрессии для секвенирования РНК и исследований микрочипов. Рез. нуклеиновых кислот 43: e47.

38. ↵

    Роджерс А. Б., Морган С.П., Леу Н.А., Бейл Т.Л. 2015. Трансгенерационное эпигенетическое программирование с помощью микроРНК сперматозоидов повторяет эффекты отцовского стресса. Proc Natl Acad Sci U S A 112: 13699–13704.

39. ↵

    Саи Лакшми С., Агравал С. 2008. piRNABank: веб-ресурс по классифицированным и сгруппированным Piwi-взаимодействующим РНК. Nucleic Acids Res 36: D173–177.

40. ↵

    Sharma U, Conine CC, Shea JM, Boskovic A, Derr AG, Bing XY, Belleannee C, Kucukural A, Serra RW, Sun F et al. 2016. Биогенез и функция фрагментов тРНК во время созревания сперматозоидов и оплодотворения у млекопитающих. Наука 351: 391–396.

41. ↵

    Шукла Г.К., Сингх Дж., Барик С. 2011. МикроРНК: обработка, созревание, распознавание мишеней и регуляторные функции. Mol Cell Pharmacol 3: 83–92.

42. ↵

    Сиддик Б., Модуит С., Симеони У., Бенахмед М. 2018. Эпигеном сперматозоидов как маркер воздействия окружающей среды и образа жизни в происхождении наследования болезней. Мутат Рез 778: 38–44.

43. ↵

    Скиннер М.К. 2014. Экологический стресс и эпигенетическое трансгенерационное наследование. BMC Med 12: 153.

44. ↵

    Skinner MK, Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, Nilsson E, McBirney M, Klukovich R, Xie Y, Tang C, Yan W. 2018. Изменения в метилировании ДНК сперматозоидов, некодирующей РНК и сохранении гистонов связаны с индуцированным ДДТ эпигенетическим трансгенерационным наследованием заболевания. Эпигенетика Хроматин 11: 8.

45. ↵

    Скиннер М.К., Маниккам М., Трейси Р., Герреро-Босанья С., Хак М., Нильссон Э.Е. 2013. Воздействие наследственного дихлордифенилтрихлорэтана (ДДТ) способствует эпигенетическому трансгенерационному наследованию ожирения. BMC Med 11: 228.

46. ↵

    Wang J, Zhang P, Lu Y, Li Y, Zheng Y, Kan Y, Chen R, He S. 2019. piRBase: обширная база данных последовательностей piRNA. Нуклеиновые кислоты Res 47: Д175–Д180.

Наверх

основных элементов, многорычажная подвеска. Volkswagen Passat B5

Volkswagen Passat B5 зарекомендовал себя как надежный, комфортный автомобиль. Автопроизводитель предложил покупателям широкий выбор комплектаций. Для этой серии концерн выпустил ошеломляющее количество двигателей – целых 17 вариантов силовых агрегатов! Машина вполне комфортная. Водителю предоставляется выбор двигателя.

Комфорт поездки складывается из факторов разной природы, в том числе немаловажной является подвеска Passat B5. Каким бы надежным он ни был, иногда приходится думать о его ремонте.

Факты со страниц истории

Концерн внимательно следил и продолжает следить за тенденциями глобального спроса. Покупатель требователен. Предлагать ему роль, плохо справляющуюся с его обязанностями, — себе во вред. Производитель должен идти в ногу с растущими потребностями и меняющимися условиями жизни. Поэтому было принято решение применить многозвенный вариант.

Подвеска «Пассата Б5» стала больше радовать владельцев этого автомобиля. Изготовление алюминия было приоритетом для дорогих автомобилей. Сегодня его внедряют в категории бюджетных автомобилей. Разработчик продолжает прислушиваться к мнению потребителей, не уставая модернизировать представленные на рынке варианты.

Задачи подвески

Между кузовом и колесами подвеска Passat B5 обеспечивает надежную синхронизацию. Задачей элементов его конструкции является передача крутящего момента на колеса. Их роль трудно переоценить, так как они выполняют смягчение динамических нагрузок, снижают вибрации кузова, формируют хорошие показатели курсовой устойчивости автомобиля и придают плавность движения.

Ключевым звеном в устройстве подвески Passat B5 является расположенная снизу поперечная балка. Двигатель крепится к балке с помощью специализированных опор.

Передняя подвеска оснащена 4 рычагами, расположенными поперек. Они играют роль поглотителей вибраций, передающихся на конструкцию кузова. В комплектации винтовые пружины, внутри которых установлены амортизаторы. Стойка амортизатора крепится к кронштейну подвески, расположенному вверху. Его нижняя часть крепится к поперечному рычагу.

Валы карданные участвуют в передаче крутящего момента на ободья посредством шарниров равных угловых скоростей. Вал включает в себя три основных элемента: внутренний, ШРУС Volkswagen Passat B5, центральную часть. Есть одна особенность — смазка меняется только при полной разборке ШРУСа.

Важный совет! Следует помнить, что на этой автозапчасти запрещены сварочные и рихтовочные вмешательства.

Аргументы для критиков

Споры и вопросы вызывает одна неприятная особенность — все рычаги подвески Passat B5 изготовлены из алюминиевых сплавов и выполнены заодно с шаровыми опорами. О приспособленности к отечественным дорогам нельзя говорить из-за излишней мягкости металла. Особенно большие проблемы возникают именно с передней подвеской, причем их больше по сравнению с задней. В редких случаях удается нарваться на 70 тыс. км., чаще всего рычаги заканчиваются уже на 40 000 пробега.

В нулевые годы инженеры немного решили проблему, предоставив возможность покупать ремкомплекты. Рестайлинг этого периода характеризуется повышенным процентом надежности этого устройства. Возникает резонный вопрос — а есть ли в принципе преимущества у подвесок этой марки?

О преимуществах многорычажной подвески

Автолюбители чувствуют себя на порядок комфортнее с установкой многорычажной подвески Volkswagen Passat B5. Его установка помогает забыть о неровностях дорожного покрытия. При попадании в яму срабатывает рычаг попавшего в нее колеса. Эта часть защищает тело от последствий сильного удара.

Удобство также сводится к тому, что сцепление колес с дорожным полотном увеличено в сто раз по сравнению с обычной подвеской. Успех операции во многом диктуется поведением автолюбителя: как часто он заглядывает в автосервис для проведения несложной диагностики, используемой манерой вождения, дорожными условиями. Аккуратные автовладельцы иногда могут достигать отметки пробега в 100 000 км. Возникает четкий вопрос: как ведет себя задняя подвеска Пассат Б5, что делать в случае неисправности?

Нюансы конструкции задней подвески

Основой устройства является балка с рычагами. Спереди установлен стабилизатор, уменьшающий крены в поворотах. Резиновые втулки крепят заднюю балку к кузову. Подпружиненные механизмы и амортизаторы смягчают движения, облегчая преодоление выбоин на автомагистралях.

Первым признаком неисправности иномарки можно назвать ее раскачивание из стороны в сторону. При износе 80% приходится менять подвеску: шаровые опоры, верхние рычаги, стойки стабилизатора, трещотки нижних рычагов, сайлентблоки задней балки с опорными кронштейнами и другие элементы. Самостоятельно поменять очень сложно — лучше обратиться в сервис.

Основные «симптомы» неисправностей

Специалисты рекомендуют прослушивать на своей «ласточке» следующие виды сигналов.

1. Кузов начинает раскачиваться при движении. Это свидетельствует о неисправности амортизаторов. Автотранспорт хуже слушается рулевых команд владельца, ускоряет процесс износа трансмиссии. Нарост провоцирует выход из рабочего режима сайлентблоков, верхних опор.
2. Длина тормозного пути перестала радовать. Неисправность ABS, ESP. Налицо прямая угроза безопасности и необходимость срочных действий.
3. Связь с шоссе ухудшается. Ослабляется упор автомобиля на все четыре колеса, снижается показатель маневренности. Водитель сталкивается с внезапными поломками в пробуксовке. Это мотивирует пройти раннюю диагностику шин, помимо подвески. Ремонт подвески Пассат Б5 своими руками не рекомендуется. Это потребует знания технического устройства и мастерства.
4. Ухудшение физических ощущений. Пассажиров начинает укачивать, снижается внимательность водителя. Кузов кренится при разгоне или торможении — ситуация опасная.
5. Слышен звук подвески — первая причина обратиться в автосервис.
6. Неравномерно изношенные шины, уменьшенный дорожный просвет, резина имеет повышенную жесткость.

Неужели все так сложно, и вы сами не можете отремонтировать хотя бы одну деталь? При достаточном опыте можно попробовать заменить сайлентблоки.

Советы по замене сайлентблоков на задней балке VW Passat B5

Данные элементы подвески автомобиля находятся в кронштейнах. Поможет правильно заменить следующий алгоритм действий:

1. Очень осторожно снимите кронштейны. Важно делать это по одному: положение луча не будет сбиваться и вам не придется переходить на развал.
2. Крепления следует открутить, вооружившись головкой под торцевой ключ на 18 мм. Покупка новых кронштейнов вкупе с сайлентблоками Фольксваген Пассат Б5 обойдется дороже ремонта.
3. Можно только купить сайлентблоки, а кронштейны оставить прежними. Для его снятия понадобится болгарка, с помощью которой делаются два пропила до появления упора. Есть еще один способ — выдавить резинометаллический шарнир. Вам понадобится пресс, сепаратор для которого подбирается по диаметру, например, он может подойти от переднего ступичного подшипника Hyundai Getz.